Experimente zur Regulation der Epstein Barr Virus (EBV) DNA-Polymerase BALF5 durch die EBV-kodierte mikroRNA BART2

Abstract

Aus Studien der Gruppe um Tuschl wurden im Jahre 2004 fünf EBV-kodierte mikroRNAs nachgewiesen. In computergestützten Verfahren wurden entsprechende Ziel-mRNAs vorhergesagt. In der vorliegenden Arbeit wird der funktionelle Einfluß der miRNA BART2 auf ihre Ziel mRNA BALF5 (virale DNA-Polymerase) untersucht. Diese ist vollständig komplementrär zur miRNA, was darauf schließen lässt, dass durch die miRNA-BART2 eine Spaltung der BALF5 mRNA hervorgerufen wird. Zunächst soll eine Verringerung der Proteinmenge nachgewiesen werden. Hierzu wurden zunächst entsprechende Reporter- (pGL3-BALF5) und Effektorkonstrukte (pSG5-BART2) hergestellt für Luciferase-Reporter-Assays. Diese Konstrukte konnten einen Nachweis zur Herabregulierung der Proteinmenge um etwa 44% erbringen.Der zweite Teil der Arbeit befasst sich mit der Gewinnung und Charakterisierung monoklonaler BALF5-Antikörper. Die DNA-Polymerase von EBV ist Ziel der miR-BART2 und somit ist es wichtig, auch auf Proteinebene einen Einfluß der miRNA nachzuweisen. Nach Immunisierung von Ratten durch Frau Dr. Kremmer (GSF, München) mit einem BALF5-Peptid konnten verschiedene Antikörper-Klone charakterisiert werden. Vor allem der Klon 4C12 eignet sich sehr gut für weitere Versuche, denn er zeigt neben einer spezifischen Antigen-Antikörperreaktion in der Immunpräzipitation und der Immunfluoreszenz wie die Antikörper 2D6, 4D10, 2E10, 7E6 und 6G7 auch eine spezifische Erkennung des BALF5-Proteins in der Western Blot-Analyse.Abschließend wurde mit den erhaltenen BALF5-Antikörpern versucht, einen indirekten Nachweis der Induktion des lytischen Zyklusses zu erbringen, der durch das Abfangen von miRNAs ausgelöst werden sollte. Allerdings war es mit den hier verwendeten Methoden nicht möglich, eine lytische Replikation von EBV auszulösen, welche indirekt über das Auftreten des early genes des lytischen Zyklusses, BALF5, nachzuweisen ist. Dies wäre von Interesse im Hinblick auf neue Ansätze in der Therapie der von latenten EBV-ausgelösten lymphoproliferativen Erkrankungen. In the year 2004, Pfeffer et al. could proof the existence of EBV encoded miRNAs with their bioinformatically determined target mRNAs.In this thesis the functional influence of the EBV-encoded miR-BART2 on its target BALF5, the viral DNA polymerase, was investigated. Particularly the complete complementarity of this pair is of special interest because of a possible cleavage of the mRNA by the miRNA.First, the down-regulation of the BALF5 protein level was indirectly shown by luciferase experiments. Therefor the pSG5-BART2 effector-construct and the pGL3-BALF5 3 UTR reporter-construct were produced. In this assay a down regulation of the BALF5 mRNA level by the miRNA-BART2 of about 44% could be shown.After having seen an influence on the molecular level, the second part of this thesis deals with the production and the testing of monoclonal BALF5 antibodies. They were produced to test the influence of the miR-BART2 on the BALF5-protein level in vivo. Rats were immunized against a BALF5 peptide by Elisabeth Kremmer, MD, GSF Munich. Eight different antibodies were characterized in Western blot, immuno precipitation, and immuno fluorescence experiments, whereas the antibody 4C12 is the most promissing showing a specific antigene detection in the Western blot analysis as well as in the other assays. In the immuno precipitation and the immuno fluorescence experiments, where native BALF5 protein was used, the antibodies 2D6, 4D10, 2E10, 7E6, and 6G7 showed a specific antigene-antibody reaction.Finally, an induction of the lytic cycle by the transfection of Raji-cells with antisense miRNAs was unsuccessfully tried to be shown with the applied methods. BALF5 as an early gene in the lytic replication, was hoped to be detected as an indirect proof of the induction of th lysis. It was of special interest for new therapeutical methods in cancer treatment. The idea behind was, that as soon as you could push a persitent to become a lytic infection the host´s immuno system could eliminate the virus out of the body.