Genomweite Kartierung von QTL mit Assoziation zur Resistenz/Empfindlichkeit gegenüber Sarcocystis miescheriana beim Schwein

Abstract

Entstehung und Ausgang von Infektionskrankheiten bei Wirbeltieren sind zumindest zu einem gewissen Grad genetisch determiniert. Dies wurde durch verschiedene Publikationen untermauert. In den meisten Fällen allerdings sind die beim Wirt phänotypische Variationen auslösenden Genvarianten nicht bekannt. Zysten bildende Kokzidien der Gattung Sarcocystis sind häufig vorkommende Parasiten bei Nutztieren. Sarcocystis (S). miescheriana ist ein einzelliger Parasit, der bei änfälligen Schweinen, die als Zwischenwirt dienen, ein akutes und chronisches Krankheitsbild verursachen kann. Meßbare Unterschiede in der Empfindlichkeit/Resistenz gegenüber S. miescheriana wurden zwischen den Rassen Meishan und Pietrain festgestellt. Jüngste Untersuchungen haben den Beweis für mittlere bis hohe Erblichkeiten dieser die Unterschiede bedingenden Faktoren geliefert und haben damit den Grundstein für die Suche nach den verantwortlichen Genorten gelegt. Ein möglicher erster Schritt zur Identifikation der kausalen Genorte und deren Varianten kann die Kartierung von Quantitative trait loci (QTL) sein. In informativen Familien können segregierende Markerallele dazu dienen, mittels QTL-Analyse Assoziationen zwischen chromosomalen Regionen und phänotypischer Variabilität festzustellen. Für die Resistenz/Empfindlichkeit von landwirtschaftlichen Nutztieren gegenüber parasitären Infektionserregern wurden bereits QTL für Kokzidienresistenzen beim Wirtschaftsgeflügel, Trypanosomentoleranzen beim Rind und Nematodenresistenzen beim Schaf gefunden. Für die vorliegende Studie wurden 101 informative von insgesamt 150 Mikrosatelliten genotypisiert. Der durchschnittliche Abstand der Marker untereinander betrug 25,2 cM. Diese Untersuchung repräsentiert die erste QTL-Studie zu Resistenzen gegenüber einer Parasitose beim Schwein. Die QTL-Kartierung wurde in einer Pietrain/Meishan-Familie mit 139 F2-Schweinen, die experimentell mit 50.000 Sporozysten von S. miescheriana im Alter von ca. 100 Tagen oral infiziert wurden, durchgeführt. Die eingesetzte, geringe Infektionsdosis rief das typische klinische Bild hervor, jedoch mit mildem Verlauf. Die erhobenen klinischen, klinisch-chemischen, hämatologischen, immunologischen und parasitologischen Merkmalsdaten dienten zur phänotypischen Beschreibung der Tiere. Die QTL-Analyse wurde mit der online-Anwendung QTL-Express durchgeführt. Die F-Wert-Schwellen wurden für genomweite Signifikanz auf 14,0 (p & #8804; 0.001), 11,2 (p & #8804; 0.01), und 8,2 (p & #8804; 0.05) geschätzt. Die F-Schwelle für chromosomweite Signifikanz war 5,5 (p & #8804; 0.05). Insgesamt konnten für klinische, klinisch-chemische, hämatologische, immunologische und parasitologische Merkmale 56 QTL auf verschiedenen Chromosomenregionen kartiert werden. Darunter 14 genomweit signifikante QTL (F & #8805; 8.2) und 42 chromosomweit signifikante (mutmaßliche) QTL (F & #8805; 5.5). Bedeutsame QTL wurden auf den Chromosomen 1, 2, 3, 4, 6, 7, 8, 10, 17, und X kartiert. Zehn und vierzehn QTL wurden für die Rektaltemperatur bzw. für die Herzfrequenz gefunden. Diese klinischen Merkmale wurden von vielen QTL mit nur kleinen Einzeleffekten beeinflusst. Dreizehn QTL konnten mit den klinisch-chemischen Merkmalen wie den Serumenzymen CK und AST assoziiert werden. Die Pietrain- und Meishan-Schweine zeigten sowohl vor als auch während der Infektion signifikant unterschiedliche CK- und AST-Werte. Die untersuchten Parameter des Blutbildes wurden von neunzehn QTL kontrolliert. Zehn QTL für die Thrombozyten- und neun QTL für die Eosinophilenzahl. Potentielle homologe Kandidatengene im Bereich dieser QTL wurden kaum festgestellt. Ein Hauptaspekt bezüglich der genetisch bedingten Unterschiede für die Resistenz/Empfindlichkeit zwischen den Ausgangsrassen Meishan und Pietrain stellte die Zahl der Bradyzoiten pro Gramm Muskelgewebe dar. Drei QTL für die Bradyzoitenzahl wurden auf SSC7 (musculus longissimus dorsi, M.l.d.; p < 0.001), SSC16 (M.l.d.) und SSC2 (Herzmuskel) kartiert. Die QTL auf SSC7 und SSC16 erklärten zusammen 44,7% der merkmalspezifischen F2-Phänotypvarianz. In allen Fällen zeigten sich Pietrainallele assoziiert mit höheren Bradyzoitenzahlen. Der QTL auf SSC7 ist der deutlichste für die Bradyzoitenzahl (F = 17.4), kartiert im Bereich des Markers LTA (lymphotoxin A). Diese Region beinhaltet Gengruppen des Haupthistokompatibilitätskomplexes (MHC) und des Tumornekrosefaktors (TNF). Zusammenhänge zwischen Unterschieden im MHC und unterschiedlichen Krankheitsempfindlichkeiten sind schon länger bekannt. TNF ist ein Zytokin, welches entscheidend an der Modulation des Immunsystems und der Zellteilung verschiedenster Zelltypen beteiligt ist. Einige QTL für immunologische Merkmale wie IgM, IgG, IgG1, und IgG2 konnten kartiert werden. Der bedeutsamste QTL in der vorliegenden Untersuchung wurde für IgG2-Titer an Tag 42 post infectionem (F = 20.9) auf SSC7, am telomerischen Ende des langen Armes kartiert. Dieser QTL im Bereich des Markers Sw764 erklärte allein 29% der IgG2-Varianz an Tag 42. Die Chromosomenregion des QTL beinhaltet das Immunglobulin heavy chain gene cluster. Diese Tatsache erklärt, dass Variationen der IgG2-Titer mit hoher Wahrscheinlichkeit direkt Allelvariationen der Gene, die für IgG2-Antikörper kodieren, zuzuschreiben sind (cis-acting). Zusammenfassend betrachtet, weisen die bedeutsamsten QTL in der akuten und chronischen Sarkozystose darauf hin, dass die Unterschiede in der Resistenz/Empfindlichkeit gegenüber dieser Erkrankung beim Schwein genetisch bedingt sind. Besonders die QTL für Bradyzoitenzahl und IgG2-Titer auf Chromosom 7 entsprechen in ihrer Größe QTL für Leistungsmerkmale, die bereits in die Züchtung integriert werden konnten. In der relativ großen Zahl an kartierten QTL mit großen Einzeleffekten spiegelt sich die Komplexität der Erreger-Wirts-Interaktionen wider. S. miescheriana steht in dieser Untersuchung exemplarisch auch für andere Parasiten, sodass die Ergebnisse einen wertvollen Ansatz zum Verständnis anderer Erreger-Wirts-Interaktionen darstellen können. Der positionelle Bezug einiger QTL zu physiologischen Kandidatengenen, wie z.B. Bradyzoiten und MHC/TNF bzw. IgG2 und Immunglobulin heavy chain gene cluster, ermöglicht die Definition von Kandidatengenen, die im Konsens zur Aufklärung molekularer Grundlagen in der Resistenz/Empfindlichkeit des Schweines gegenüber S. miescheriana beitragen. Der Nachweis der für die gefundenen herausragenden QTL verantwortlichen Gene wird das Hintergrundwissen über Erreger-Wirts-Interaktionen und besonders über Mechanismen der Erregerabwehr verbessern. Mit Hilfe marker-gestützter Selektionsverfahren (MAS) könnten die verantwortlichen Genvarianten künftig zur Verbesserung des Gesundheitsmanagements in der Schweineproduktion eingesetzt werden. The development of infectious diseases in vertebrates is gradual under genetic control. This has been stated in various different publications. But in most cases the gene loci contributing to such phenotypic variations of the host are unknown. Cyst-forming coccidia of the genus Sarcocystis are among the most prevalent parasites of livestock animals. Sarcocystis miescheriana (S. miescheriana) is a protozoan parasite causing acute and chronic disease in susceptible pigs as an intermediate host. In swine marked differences in resistance/susceptibility to S. miescheriana have been described in studies between Chinese Meishan and European Pietrain pigs. Recent research has provided evidence that these differences are significantly heritable, providing the basis to search for responsible gene loci. One practicable start towards the identification of underlying genes and gene variants may be the mapping of quantitative trait loci (QTL). With alleles of marker loci segregating within informative families, QTL analysis correlates chromosomal regions with phenotypic variation. Concerning the resistance/susceptibility of farm anamals to parasitic infections, QTL have been mapped for coccidia resistance in poultry, trypanotolerance in cattle, and intestinal nematode resistance in sheep. For the present study 101 informative of 150 microsatellites were genotyped to give an average distance of 25.2 cM between them. The survey represents the first QTL study on resistance to parasitosis in pigs. QTL mapping was performed in 139 F2 pigs of a Meishan/Pietrain family challenged orally at the age of 100 days with 50.000 sporocysts of S. miescheriana. The low doseage produced the typical clinical picture with a mild form of the disease. Clinical, clinical-chemical, haematological, immunological and parasitological traits were surveied to describe the animals phenotypes. QTL analysis was performed using the web-based application QTL-Express . F values for genome-wide significance thresholds were estimated as approximately 14.0 (p ≤ 0.001), 11.2 (p ≤ 0.01), and 8.2 (p ≤ 0.05). The F threshold for chromosome-wide significance was 5.5 (p ≤ 0.05). Altogether 56 QTL for clinical, clinical-chemical, haematological, parasitological, and immunological traits were mapped to several chromosomal areas, among them 14 genome-wide significant QTL (F ≥ 8.2) and 42 chromosome-wide significant (putative) QTL (F ≥ 5.5). Major QTL were mapped on chromosomes 1, 2, 3, 4, 6, 7, 8, 10, 17, and X. Ten and thirteen QTL were found for rectal temperatures and heart rates, respectively. Clinical traits seem to be controlled by many QTL, each with only minimal effects. Thirteen QTL were associated with clinical-chemical traits like serum enzymes CK and AST. Pietrain and Meishan pigs differed significantly in serum AST and CK levels before and during infection. The included haematological traits were controlled by nineteen QTL: Ten QTL for platelets and nine QTL for numbers of eosinophils. Potential homologous candidate genes were hardly detectable in the areas of these QTL. One major aspect of the genetic difference in resistance between Meishan and Pietrain was the number of bradyzoites per gram of muscle tissue. Three QTL for bradyzoite numbers mapped to SSC7 (musculus longissimus dorsi, M.l.d.; p < 0.001), SSC16 (M.l.d.) and SSC2 (cardiac muscle). The QTL on SSC7 and SSC16 together explained 44.7% of the trait specific F2 phenotypic variance. Pietrain alleles increased bradyzoite numbers. The QTL on SSC7 (F = 17.4) mapped to the marker range of LTA (lymphotoxin A), a region containing gene clusters of major histocompatibility complex (MHC) and TNF. Associations of MHC variability with disease susceptibility are already known and TNF is a proinflammatory cytokine, which mediates many immune functions and the growth of various cell types. Several QTL were detected for immunological traits IgM, IgG, IgG1, and IgG2. The most prominent QTL of the present study was mapped for IgG2 titers on day 42 post infection (F = 20.9) to SSC7, on the telomere of the long arm of the chromosome. Located in the range of marker Sw764, this QTL explained 29% of the IgG2 variance on day 42. The region of the QTL contains the immunglobulin heavy chain gene cluster. This fact indicates that variation in IgG2 levels might be due to allelic variation directly within a gene coding for IgG2 antibodies (cis-acting). In conlusion, major QTL for the traits studied in the course of acute and chronic sarcocystosis suggest genetically based differences in resistance/susceptibility to the disease in swine. Especially the QTL for bradyzoite numbers and IgG2 titers on SSC7 explain phenotypic variance ratios comparable to QTL already implemented in practical breeding for swine performance. Relatively large numbers of QTL with major effects reflect the high complexity of host-parasite interaction. S. miescheriana used in this study stands exemplarily for other parasitoses, and the results might have a valuable impact on the understanding of other host-parasite interactions. Positional associations of several of the QTL with physiological candidate genes like e.g., bradyzoites and MHC/TNF, IgG2, and Ig heavy chain gene cluster, respectively, provide some candidate genes, which should lead to an elucidation of the molecular basis of resistance/susceptibility of pigs to S. miescheriana. Establishing the responsible genes and variants might help to improve our knowledge on host-parasite interactions, especially host defense mechanisms. Gene variants might be used for the improvement of herd performance in swine in the future.