Herstellung eines monoklonalen Antikörpers gegen felines MHC II und dessen immunhistologische Anwendung

Abstract

Zur Herstellung eines monoklonalen Antikörpers wurde komplettes Felines Leukämievirus (FeLV) als Immunisierungssuspension verwendet. Statt des erwarteten Antikörpers gegen FeLV ergaben das immunhistologische Screening auf Zell- und Gewebeproben sowie die Feststellung des Molekulargewichts des durch den monoklonalen Antikörper F7 1 D4 F6 H4 nachgewiesenen Antigens, dass es sich um einen Antikörper gegen die beta-Kette des felinen MHC Klasse II-Antigens handelt. Vergleichende immunhistologische Untersuchungen auf Gewebeproben von domestizierten Katzen, Wildfeliden, verschiedenen Haustieren sowie einer Ratte und vom Mensch ergaben, dass es sich bei dem hergestellten Antikörper um einen Antikörper handelt, der hauptsächlich mit Zellen von Feliden und nur mit einzelnen Zellen von Schaf und Ziege reagiert. Die Tatsache, dass die untersuchten Katzen nicht miteinander verwandt sind, führt zu dem Schluss, dass der Antikörper an eine monomorphe Determinante des MHC Klasse II-Antigens bindet. Des Weiteren wurde die MHC Klasse II-Expression auf felinen peripheren, mononukleären Zellen mit dem monoklonalen Antikörper F7 1 D4 F6 H4 im Durchflusszytometer sowie immunzytologisch in Blutausstrichen und Zytozentrifugenpräparaten getestet. Die unterschiedlichen Untersuchungsmethoden führten zu demselben Ergebnis, nämlich positiv reagierenden Lymphozyten und Monozyten. Bei den immunhistologisch und -zytologisch untersuchten Zelllinien FL 74, FL 4, CrFK und FE zeigten die FL 74-Zellen die höchste MHC Klasse II-Expression. Die immunhistologische Untersuchung wurde retrospektiv an Formalin-fixiertem, Paraffin-eingebettetem Organmaterial von 50 domestizierten Katzen durchgeführt. Neben SPF-Katzen wurden FeLV-negative und -positive Tiere (ohne und mit vorberichtlich erwähnten neurologischen Symptomen) sowie FIP-Fälle und FIV-positive Katzen ausgewählt. Das Organspektrum umfasste hauptsächlich Gehirnproben und lymphatische Gewebe. Bei allen Gruppen lagen in unterschiedlichem Ausmaß auch verschiedene große Parenchyme (z. B. Lunge, Leber, Niere, Pankreas) vor. Die Organe der SPF-Katzen wiesen die geringste MHC Klasse II-Expression auf. Die Art der positiven Zellen beschränkte sich hauptsächlich auf die in der Literatur bei Mensch und Katze als konstitutiv MHC Klasse II-Antigen exprimierend beschriebenen Zellen. Die Gruppe der FeLV-negativen Katzen zeigte insgesamt bereits eine stärkere Reaktion der gleichen Zellarten. Die durch neurologische Symptome abgegrenzte Gruppe der FeLV-negativen Katzen zeichnete sich besonders durch entzündliche Prozesse in Gehirn und Rückenmark aus. In diesen Bereichen wiesen vor allem mononukleäre Infiltratzellen und Myelinophagen eine starke MHC Klasse II-Expression auf. Im Vergleich der Virus-negativen Katzengruppen mit den Virus-positiven Katzengruppen wiesen Letztere deutlich mehr positive MHC II-Reaktionen auf, bezogen sowohl auf die Anzahl der verschiedenen positiven Zellarten als auch auf die Menge der positiven Zellen. Im Gehirn der FeLV-positiven Tiere (beide untersuchten Gruppen) konnte eine deutlich verstärkte Expression von MHC II durch Endothelzellen und Mikrogliazellen mit Bildung von positiven Gliaknötchen nachgewiesen werden. Bei der Gruppe der FeLV-positiven Tiere mit neurologischen Symptomen fanden sich die positiven Endothelzellen vor allem in den Meningen. Im Gehirn der FIV-positiven Katzen reagierten die drei Zellarten Perizyten, Mikrogliazellen und Endothelzellen jeweils vergleichbar stark. Die Gruppe der FIP-Katzen wies von allen untersuchten Katzengruppen die stärkste induzierte Expression von MHC Klasse II-Antigen auf. Im Gehirn fanden sich starke positive Reaktionen, vor allem der Endothelzellen und Mikrogliazellen, auch in Form von Gliaknötchen sowie der Plexus choroideus-Zellen und Ependymzellen. Außerdem reagierten zahlreiche Epithelzellen in Darm, Pankreas, Niere und Lunge positiv. Somit konnte anhand der immunhistologischen Untersuchungen mit dem felinen, monoklonalen Antikörper F7 1 D4 F6 H4 sowohl die konstitutive Expression von MHC Klasse II-Antigen auf einem breiten Organspektrum inklusive Gehirnproben als auch die induzierte Expression des MHC Klasse II-Antigens, die besonders bei FIP-Katzen vorkommt, nachgewiesen werden. Complete feline leukemia virus (FeLV) was used to induce a monoclonal antibody. However, immunohistological screening on cell and tissue samples as well as the molecular weight of the recognized antigen indicated that the obtained monoclonal antibody, designated F7 1 D4 F6 H4, is specific for feline MHC class II beta chain. Comparing the immunohistological results on tissue samples of domestic cats, wild felids, different domestic animals, a rat and of human tissue showed that F7 1 D4 F6 H4 mainly reacts with antigen on cells of felids. Only single cells of sheep and goat were also positive. As the chosen cats were unrelated, it is obvious that the antibody binds to a monomorphic epitope of the MHC class II antigen. Furthermore, the distribution of MHC class II antigen on feline peripheral blood mononuclear cells was examined by using F7 1 D4 F6 H4 in flow cytometric analysis as well as in immunocytological staining of blood smears and cytospin preparations. The different methods led to the same result: only lymphocytes and monocytes were positive. The cell lines FL 74, FL 4, CrFK and FE have been examined immunohisto- and -cytologically. F7 1 D4 F6 H4 reacted most intensely with FL 74 cells. The immunohistological investigations were performed on formalin-fixed, paraffin-embedded tissues of 50 domestic cats. The following groups were established: SPF (specific pathogen-free) cats, FeLV-negative and -positive cats (with or without neurological symptoms mentioned in case history), cats suffering from FIP, and FIV-positive cats. The main focus of investigation were brain and lymphatic tissues. However, in each group additional tissues were examined, e. g., lung, liver, kidney and pancreas. Comparing the examined groups, the organs of the specific pathogen-free cats showed the lowest reactivity. In this group the pattern of tissue staining is similar to that described for the constitutive expression of MHC class II antigens in other cats and in humans. In the group of FeLV-negative cats without neurological symptoms mentioned in case history, a higher number of the same cells reacted with F7 1 D4 F6 H4. The group of FeLV-negative cats with a report of neurological symptoms in case history differed especially by showing frequently histopathological signs of inflammation in cerebrum and spinal chord. Upregulation of MHC class II antigen was most intense in these sites and inflammatory infiltrates as well as myelinophages reacted intensely with F7 1 D4 F6 H4. Comparing the results of the virus-negative groups with those of the virus-positive groups, the latter showed a marked increase of MHC class II antigen expression, both in types of positive cells and in the number of positive cells in total. In the brain of the FeLV-positive cats (with as well as without neurological symptoms mentioned in case history) especially endothelial and microglial cells expressed MHC class II antigen. Additionally, small positive glial nodules were found in the neuropil. The group of FeLV-positive cats with neurological symptoms in case history showed an upregulation of MHC class II antigen mainly in endothelial cells of the leptomeninges. The FIV-positive cats showed a strong positive uniform reaction on pericytes, endothelial cells and microglial cells. From all examined groups, the cats suffering from FIP showed the most intense induced expression of MHC class II antigen. In the brain not only numerous endothelial and microglial cells, but also choroid plexus epithelial cells and ependymal cells expressed MHC class II antigen. Small positive glial nodules were found in the neuropil. Furthermore, in these cats many different epithelial cells in small intestine, pancreas, kidneys, and in lung tissue reacted with F7 1 D4 F6 H4. In conclusion, by means of immunohistological investigations with the murine monoclonal antibody F7 1 D4 F6 H4, it was possible to describe the constitutive expression of MHC class II antigen in a broad organ spectrum including brain samples. Furthermore, it was proven that the expression of MHC class II antigens is upregulated in organs of virus-infected animals, especially in cats suffering from FIP.