Untersuchungen zum immunhistologischen Nachweis verschiedener Strukturproteine des Felinen Infektiösen Peritonitis (FIP)-Virus

Abstract

Ziel dieser Arbeit war es, die immunhistologische Diagnostik der Felinen Infektiösen Peritonitis (FIP) zu optimieren. Hierfür wurden Antikörper eingesetzt, die gegen Epitope der Nukleokapsid-, Membran- und Spikeproteine des Felinen Coronavirus (FCoV) gerichtet waren.2. In der Literaturübersicht werden Coronaviren im Allgemeinen und FCoV im Speziellen vorgestellt. Es wird der gegenwärtige Kenntnisstand in Bezug auf die virale Replikation der Coronaviren sowie auf Epizootiologie und Pathogenese der FIP dargelegt.3. Zunächst wurden eigene immunhistologische Untersuchungen mit fünf monoklonalen Antikörpern (FCV3-70, 52D5, F19-1, 6F7 und 1F12) an Gewebschnitten von FIPV-positiv getesteten Organen durchgeführt. Hierbei wurden die für die jeweiligen Antikörper besten Vorbehandlungen und Nachweismethoden ermittelt. Wichtige Kriterien für die Beurteilung waren die Reaktionsintensität der monoklonalen Antikörper und eine möglichst geringe Hintergrundfärbung, das heißt eine gute "Signal-Noise-Ratio". 4. Für die getesteten monoklonalen Antikörper erfüllte die PAP-Methode am besten die in Punkt 3 erwähnten Anforderungen. 5. Spike(S)- und Membran(M)-Protein des FCoV wurden in Makrophagen als dunkelbraunes Präzipitat vor allem im perinukleären Gebiet nachgewiesen. Das Nukleokapsidprotein (N-Protein) stellte sich dagegen als feingranuläre braune Färbung im gesamten Zytoplasma dar. Diese Beobachtungen unterstützen die Vorstellung, dass die M- und S-Strukturproteine im Golgi-Apparat vorhanden sind, während das N-Protein im gesamten Zytoplasma akkumuliert. 6. Die Untersuchung der an FIP erkrankten Katzen des Sektionsgutes im Rahmen dieser Doktorarbeit ergab, dass von den großen Parenchymen die Nieren am häufigsten Granulome aufwiesen. 7. Die immunhistologische Markierung von Granulomen in den Nieren von 21 an FIP erkrankten Katzen wurde unter Verwendung des Standardantikörpers FCV3-70 in 4 verschiedene Reaktionsintensitätsstufen eingeteilt. Als Negativkontrolle fungierten Organe von 10 Katzen, die an einem Trauma oder sonstigen anderen Krankheiten als der FIP verstorben waren, und 2 SPF(specific pathogen free)-Katzen, die aus einem FeLV(Felines Leukämievirus)-Versuch stammten.8. Der Frischegrad der untersuchten Tiere hatte außer für den Spike-Protein nachweisenden mAk 1F12 keinen signifikanten Einfluss auf den immunhistologischen Nachweis von Virusproteinen.9. Die Ergebnisse der Markierung durch den Standardantikörper FCV3-70 wurden mit denen der einzeln verwendeten übrigen vier monoklonalen Antikörper und mit denen des Cocktails (Kombination von FCV3-70, 52D5, F19-1 und 1F12) verglichen, die gegen verschiedene Strukturproteine des Felinen Coronavirus gerichtet waren. Die monoklonalen Antikörper wurden untereinander anhand der Reaktionsintensität verglichen. 10. Die Reaktionsintensität der einzeln verwendeten Antikörper, die das N- bzw. das M-Protein nachwiesen, war am höchsten (FCV3-70, 52D5 und F19-1). Die Verwendung des gegen das S-Protein gerichteten monoklonalen Antikörpers 1F12 erscheint aufgrund der geringen Reaktionsintensität als alleiniges Diagnostikmittel nicht sinnvoll.11. Die Kombination von vier der fünf monoklonalen Antikörper in einem Cocktail erbrachte die höchste Sensitivität und Spezifität. 12. Mit der entsprechenden Vorbehandlung (Zitratpuffer pH-Wert 6,0) eignet sich der Standardantikörper FCV3-70 als einzeln eingesetzter monoklonaler Antikörper für die Diagnostik.

The purpose of this study was to optimize the immunohistochemical diagnosis of Feline Infectious Peritonitis (FIP). Monoclonal antibodies specific for epitopes in nucleocapsid(N)-, membrane(M)-, and the spike(S)-proteins of the Feline Coronavirus (FCoV) were applied.2. Coronaviruses in general and feline coronaviruses in particular are discussed in the literature review. Additionally, the current knowledge about viral replication of coronaviruses as well as epizootiology and pathogenesis of FIP are discussed. 3. The optimal conditions for the immunohistochemical diagnosis of FIP using five different monoclonal antibodies (FCV3-70, 52D5, F19-1, 6F7, 1F12) were established using sections of different tissues from FIP-positive cats as positive control material. Reaction intensity and low non-specific background staining (i.e. a good signal-to-noise-ratio) were the key discriminating criteria on which judgement of the quality of immunostaining was based.4. The Peroxidase-anti-peroxidase (PAP)-method yielded the optimal staining of sections for the monoclonal antibodies tested.5. The spike(S)- and membrane(M)-protein-specific immunostaining were typically observed as a circumscribed precipitate near the nucleus of the macrophage whereas the nucleocapsid(N)-protein-specific immunostaining was granular and distributed throughout the entire cytoplasm. These results support the hypothesis that M- and S-proteins accumulate in the Golgi apparatus whereas the nucleocapsid assembles throughout the cytoplasm, resulting in a more diffuse intracytoplasmic positive signal.6. Histological review of the tissue sections from the FIP-diseased cats in this study showed that, of the parenchymatous organs, the kidneys were the site of the most severe lesions.7. Kidney sections from 21 FIP-diseased cats were graded as to the degree of postmortal deterioration and as to the immunohistochemical reaction intensity using antibody FCV3-70 as the primary antibody. Tissue sections of ten cats, whose cause of death was other than FIP and two SPF(specific pathogen free) cats served as negative controls.8. The degree of postmortal deterioration had except for the S-Protein detecting mAb 1F12 no significant influence on the immunohistological detection of viral epitopes.9. The intensity of immunostaining of the FCV3-70 antibody was compared to that of the other four monoclonal antibodies individually and to a cocktail of four monoclonals. 10. The monoclonal antibodies specific for the M- and N-proteins (52D5, F19-1 and FCV3-70) used individually gave the best results. Use of the anti-S protein monoclonal antibody 1F12 alone for the immunohistochemical diagnosis of FIP is not recommended because of the low reaction intensity observed. 11. Combining four antibodies (FCV3-70, F19-1, 6F7, 1F12) as a "cocktail" yields the best results as to sensitivity and specificity.12. With adequate pre-treatment of tissue sections (citrate buffer pH-value 6.0) the use of the standard antibody FCV3-70 (anti-FCoV N-protein) is suitable for diagnostic purposes.