Vergleichende Untersuchungen zum Nachweis von Mycobacterium avium ssp. paratuberculosis in Milchrinderbeständen

Abstract

Die Paratuberkulose des Rindes wird von Mycobacterium avium ssp. paratuberculosis (MAP) hervorgerufen. Da eine Beteiligung von MAP am Krankheitsgeschehen des Morbus Crohn beim Menschen nicht auszuschließen, dieser Erreger in Tierbeständen weit verbreitet ist und insbesondere Lebensmittel tierischen Ursprungs als Vektoren in Verdacht stehen, ist die Etablierung eines zuverlässigen und schnellen Verfahrens zum frühzeitigen Nachweis des Erregers in Milchrinderbeständen von entscheidender Bedeutung.In der vorliegenden Arbeit wurde deshalb ein institutseigenes TaqMan® Real-Time PCR-Verfahren (Schönenbrücher et al., 2008) basierend auf den spezifischen MAP-Markern F57 und ISMav2 in Kombination mit vier unterschiedlichen DNA-Extraktionsverfahren zum Nachweis von MAP aus artifiziell kontaminierten sowie nativen Rinderkotproben vergleichend untersucht. Bei den vier DNA-Extraktionsverfahren handelte es sich um zwei Standard- sowie zwei modifizierte DNA-Extraktionsverfahren mit einer zusätzlichen mechanischen Aufreinigung der Fäzesproben. Die Ergebnisse der artifiziell kontaminierten Rinderkotproben lassen klar erkennen, dass die mechanische Aufreinigung der Rinderkotproben sowie eine erhöhte Koteinwaage bei der DNA-Isolierung aus der Matrix Rinderkot einen entscheidenden Vorteil beim molekularbiologischen Nachweis von MAP bietet. Unter Berücksichtigung der modifizierten thermisch-chemisch-mechanischen DNA-Extraktionsverfahren konnten mit dem institutseigenen TaqMan® Real-Time PCR-Verfahren Erregerkonzentrationen von 102 KbE/g Rinderkot mit einer Nachweiswahrscheinlichkeit von 100 % erzielt werden. Bei der Untersuchung von 206 voruntersuchten, nativen Rinderkotproben wurde mit dem TaqMan® Real-Time PCR-Verfahren eine Spezifität von 100 % und eine Sensitivität von 91,6 % im Vergleich zu der Kotkultur, dem gold standard der Paratuberkulosediagnostik, bestimmt. Vergleichend wurde bei den Untersuchungen dieser nativen Rinderkotproben ein nested-PCR-Verfahren (Bull et al., 2003) basierend auf dem MAP-Marker IS900 mitgeführt, das eine Spezifität von 100 % und eine Sensitivität von 84,2 % erreichte. Die Ergebnisse der Untersuchungen zeigen, dass das institutseigene TaqMan® Real-Time PCR-Verfahren, kombiniert mit weiterentwickelten und modifizierten DNA-Extraktionsverfahren, einen zuverlässigen Erregernachweis aus der Matrix Rinderkot gewährleistet. Mit diesem molekularbiologischen Nachweissystem kann eine sensitive, spezifische und zugleich schnelle Methode für die Routinediagnostik von Mycobacterium avium ssp. paratuberculosis (MAP) in Rinderkotproben zur Verfügung gestellt werden. Mycobacterium avium ssp. paratuberculosis (MAP) is the aetiological agent of paratuberculosis. It has also been implicated as a possible cause of Morbus Crohn; MAP is widely spread in dairy herds; particularly foods of animal origin are suspected to be acting as vectors by transferring this pathogen. On account of this, establishing a reliable and fast method to detect MAP in dairy herds is of essential importance.In this study a TaqMan® real-time PCR-assay (Schönenbrücher et al., 2008) based on the MAP species-specific markers F57 and ISMav2 was combined with four different protocols for DNA-extraction to detect MAP in experimentally and naturally contaminated faecal samples. Two standard and two modified protocols for DNA-extraction were applied. The two modified protocols included a mechanical disruption of the faecal samples. Results of the experimentally contaminated faecal samples clarified the advantages of the mechanical disruption of the faecal samples and a higher content of faeces for DNA-extraction. The detection limit of the TaqMan® real-time PCR-assay in consideration of the modified DNA-extraction protocols was consistently found to be 102 CFU/g faeces. For the detection of MAP in well-selected naturally faecal samples (n = 206) the specifity and the sensitivity of the TaqMan® real-time PCR-assay were determined to be 100 % and 91,6 %. In comparison with these results the specifity and the sensitivity of a nested-PCR-assay based on the MAP species-specific marker IS900 were determined to be 100 % and 84,2 % for the identical faecal samples. Results from these studies approve that the TaqMan® real-time PCR-assay in combination with enhanced and modified DNA-extraction techniques is a sensitive, specific and fast method for routine MAP screening of faecal samples.