Die Expression von c-myc während der Auswanderung von Prämyoblasten in die Gliedmaßenanlage des Vogelembryos und die Validierung von Konstrukten zur Funktionsanalyse durch RNAi

Abstract

Die Gliedmaßenentwicklung ist Gegenstand vieler wissenschaftlicher Untersuchungen. Allerdings ist noch nicht vollständig geklärt, ob die Auswanderung der Prämyoblasten aus der lateralen Dermomyotomlippe in die Gliedmaßenanlage durch Proliferation, Motilität oder einer Mischung aus beidem zustande kommt.Da c-Myc eine essentielle Rolle in der Zellproliferation spielt, eignet es sich gut dazu, mit Hilfe der Methode der RNAi diese Fragestellung zu beantworten. Als Grundlage hierfür wurde zunächst die Expression von c-myc während der Auswanderung der Prämyoblasten in die Gliedmaßenanlagen des Vogelembryos in den Stadien HH 17 bis HH 30 untersucht. Das Ergebnis ist eine deutliche Expression im Sklerotom, in der medialen und der lateralen Dermomyotomlippe, in den migrierenden Prämyoblasten und den Vormuskelmassen. Im nächsten Schritt wurden die zuvor hergestellten shRNA-Konstrukte zum Knockdown von c-myc an Hühnerembryonen getestet. Eine Mischung aus den Plasmiden H1 677 und H1 1374 führte zu einem Silencing-Effekt. Mit diesen Konstrukten wird somit die Möglichkeit geschaffen, die Fragestellung der Auswanderungsmethode der Prämyoblasten in weiteren Forschungsarbeiten zu klären.Um einen Ausblick auf mögliche weitere Vorgehensweisen in Folgearbeiten zu geben, wurde sowohl das Migrationsverhalten der mit dem shRNA-Konstrukt transfizierten Zellen, als auch die Auswirkungen eines Knockdowns von c-myc auf die Expression von Pax3 durch erste Versuche beurteilt. Ein großer Teil der transfizierten Zellen bleibt in der lateralen Dermomyotomlippe zurück, was mit großer Wahrscheinlichkeit auf eine verringerte Proliferationsrate der Zellen zurückzuführen ist. Eine weitere Ursache stellt die Herunterregulierung der Expression von Pax3 dar, was wiederum zu einer negativen Expressionskontrolle von c-met und Lbx1 führt. Der andere Teil der transfizierten Zellen migriert die physiologische Strecke in die Gliedmaßenanlagen, um dort die Vormuskelmassen zu bilden. Dies erfolgt mit großer Wahrscheinlichkeit durch Motilität der Zellen aufgrund von CXCR4/SDF1 sowie einer noch gering vorhandenen Expression von c-met. Limb development has been addressed in numerous scientific investigations. But it is not completely clear yet, if the migration of myogenic precursor cells - out of the lateral lip of the dermomyotome into the limb bud - is a consequence of proliferation, motility or a mixture of both.Because of the essential function of c-Myc in proliferation there is a good chance to answer this question by means of the method of RNA interference. As a base it has been necessary to analyze the expression pattern of c-myc during the migration of the myogenic precursor cells out of the lateral lip of the dermomyotome into the limb bud in chicken embryo at the stages HH 17 to HH 30. A clear expression can be observed in the sklerotome, in the medial lip and lateral lip of the dermomyotome, in the migrating myogenic precursor cells and in the premuscle masses.The next step was the testing of the shRNA constructs, which had been designed for a downregulation of c-myc. A mixture of the H1 677 and the H1 1374 plasmids caused a silencing effect. With these constructs it will be possible in further research studies to get an answer to the question how the myogenic precursor cells migrate into the limb bud.To give an outlook on possible further procedures in following research projects the characteristics of the cells which were transfected with the shRNA construct have been assessed in first experiments. Furthermore the effect of a knockdown of c-myc on the expression of Pax3 has been analysed. A great part of the transfected cells remains in the lateral lip of the dermomyotome, which could be caused by a decrease of proliferation of these cells. Another reason is the down regulation of the expression of Pax3 which leads to a decreased expression of c-met and Lbx1. The other part of the transfected cells migrates the same distance into the limb bud as in control embryos in order to form the premuscle masses. This migration could be a result of motility of these cells caused by CXCR4/SDF1 and of an expression of c-met on a low level.