Immunhistochemische Untersuchungen zur Myelinisierung und Rolle der Oligodendroglia im Gehirn nach neonataler aerogener Infektion von Lewis Ratten mit dem Borna Disease Virus

Abstract

Die Bornasche Krankheit (Borna Disease, BD) ist eine vor allem bei Pferden und Schafen in Zentraleuropa auftretende schwere, häufig tödlich endende immunvermittelte Meningoenzephalomyelitis. Neurone gelten als Hauptzielzellen des BDV bei der natürlichen BD, jedoch können im Verlauf der Infektion auch Oligodendrozyten und weitere Gliazellen involviert sein.Die experimentelle Infektion von neugeborenen Ratten resultiert in lebenslanger Viruspersistenz ohne Enzephalitis und dient als repräsentatives Modell zur Erforschung von Störungen der Hirnentwicklung und Hirnfunktion. Die experimentelle Infektion von neugeborenen Ratten ist weiterhin gekennzeichnet durch eine generalisierte Ausbreitung virusspezifischer Antigene in allen ZNS-residenten Zellen.Ziel der vorliegenden Studie war die Untersuchung des Einflusses des BDV auf die Oligodendrozyten unter besonderer Berücksichtigung ihrer Hauptfunktion, der Myelinisierung des ZNS. Die Myelinogenese setzt sich postnatal fort und ist daher besonders empfindlich gegenüber Hirnentwicklungsschäden durch perinatalen Insult.30 Lewis Ratten wurden neonatal durch Exposition mit einem Aerosol einer virushaltigen Suspension infiziert. Gegenstand dieser Studie waren zusätzlich zwei Mütter und drei Sentinels, die mit den infizierten Tieren vergesellschaftet waren, sowie acht Kontrollratten.Sagittale Gehirn-Paraffinschnitte wurden mit Hämatoxylin-Eosin (HE) und Kresylviolett (KV) angefärbt. Es wurden immunhistochemische Färbungen zur Detektion des viralen Nukleoproteins (p38) und Phosphoproteins (p24) sowie zur Charakterisierung infiltrierender Immunzellen angefertigt. Oligodendrozyten wurden immunhistochemisch mithilfe eines Olig2-Antikörpers visualisiert. Eine Einschätzung der Myelinisierung erfolgte durch eine Standardmyelinfärbung mit Sudanschwarz (SSW) sowie durch immunhistochemische Darstellung des Basischen Myelinproteins (MBP). Der Myelinisierungsgrad wurde semiquantitativ durch mikroskopische Begutachtung klassifiziert.18 neonatal infizierte Ratten zeigten das typische Bild der persistierenden immuntoleranten Infektion ohne infiltrierende Immunzellen. Daneben bestand bei diesen Tieren vorwiegend im Corpus callosum und Cerebellum eine ausgeprägte Mikrogliose. Die Virusproteine N und P zeigten eine disseminierte Verbreitung im gesamten ZNS-Gewebe. Oligodendrozyten fielen besonders im Corpus callosum durch eine Tendenz zur Bildung von Clustern auf. Dies war begleitet von einer erhöhten Oligodendrozyten-Zellzahl. Olig2+ Zellen waren BDV-infiziert, und viele dieser Zellen zeigten lytische Veränderungen der Zellkerne, wie beispielsweise fokale Vakuolisierung. Eine verminderte Myelinexpression fand sich in den mit Sudanschwarz und MBP-Antikörper angefärbten Gehirnschnitten der neonatal infizierten Ratten. Zusätzlich wurden morphologische Abweichungen der Myelinstruktur wie fragmentierte oder perlschnurartige Myelinscheiden nachgewiesen.Für das Myelindefizit gibt es mehrere Erklärungsansätze. Da die Hypomyelinisierung im Gehirn der NBAE-Ratten nicht mit einem Verlust von Oligodendrozyten assoziiert war, ist dieser Phänotyp möglicherweise Folge eines toxischen Effekts auf Oligodendrozyten und Myelin nach abgeschlossener Myelinformation, beispielsweise durch Sekretionsprodukte aktiverter Mikroglia/Makrophagen. Alternativ könnte die Hypomyelinisierung auch aus einer gestörten funktionellen Interaktion zwischen Oligodendrozyten und Axonen und/oder einer gestörten Maturation der Oligodendrozyten resultieren. Da das BDV als nicht-zytolytisch gilt, wurde vermutet, dass es mit Signalwegen interferiert, die für die Funktionen der Oligodendrozyten im Rahmen der Myelinisierung und Reifung von Axonen essentiell sind. Das Phosphoprotein ist möglicherweise für diesen Effekt verantwortlich, indem es die Phosphorylierung von Neurofilamenten kompetitiv beeinflusst. Ein geringerer Phosphorylierungsgrad von Neurofilamenten hat entscheidende Konsequenzen auf die Myelinisierung und axonale Reifungsprozesse. Die vermutete Hypothese sollte mit elektronenmikroskopischen Untersuchungen gestützt werden.Der Anstieg Olig2-exprimierender Zellen im Corpus callosum der NBAE-Ratten kann als Zeichen einer Remyelinisierung mit Proliferation und Migration von Oligodendrozyten-vorläuferzellen gedeutet werden.Eine gestörte Myelinisierung beeinträchtigt sämtliche Hirnfunktionen, insbesondere die Gedächtnisleistung und das Verhalten. Die Pathologie der weißen Substanz spielt daher möglicherweise eine signifikante Rolle bei der neurologischen Erkrankung neonatal BDV-infizierter Ratten. Borna disease (BD) is a severe, frequently fatal, immune-mediated meningoencephalomyelitis that most commonly affects horses and sheep in central Europe. Although neurons represent the main cellular targets of BDV infection in natural BD, oligodendrocytes and other glial cells may become involved as the infection progresses.Experimental infection of neonatal rats results in lifelong viral persistence without encephalitis and provides an intriguing model for disturbances of brain development and function. The experimental infection of neonatal rats is further characterized by the wide distribution of viral antigens in all resident brain cells.The aim of the present study was to analyze the influence of BDV on oligodendrocytes, especially regarding their main function, myelination of the central nervous system. The myelinogenesis continues to mature after birth and is particularly vulnerable to developmental damage following perinatal insult.30 Lewis rats were infected as newborns by exposure to virus-containing aerosol. The study also includes two mothers and three sentinels, which were cohabitated with the infected animals, and eight control rats.Paraffin-embedded sagittal sections of the brains were stained with hematoxylin-eosin (HE) and cresyl-violet (KV). Immunohistochemistry was carried out to detect the viral nucleoprotein (p38) and phosphoprotein (p24) and to characterize invading immune cells. The oligodendrocytes were visualized immunohistochemically using Olig2 antibody. To prove the myelination in the central nervous system, the sections were stained with sudan black (SSW), and by using immunohistochemistry with anti myelin basic protein (MBP) antibody. The degree of myelination was graded semiquantitatively by microscopic examination of the sections.18 of the neonatally infected rats showed the typical pattern of persistent immune-tolerant infection. The viral proteins N and P showed a dissiminated distribution within the brain. The infection was associated with strong microgliosis, predominantly in corpus callosum and cerebellum. Oligodendrocytes were distributed throughout the brain, especially the corpus callosum, with a tendency for cluster formation. This was associated with an increase in the number of oligodendrocytes. Olig2+ cells were found to be infected, and many of these cells exhibited morphological changes in the nuclei, i.e. focal vacuolation. Decreased myelin expression was seen in brain sections from neonatally infected rats, when stained with sudan black (SSW) and for myelin basic protein (MBP). In addition, morphological changes in the myelin such as a fragmented or beaded appearance of the myelin sheath were found.Some possible explanations for the myelin deficit exist. Hypomyelination in NBAE rat brain was not related with a loss of oligodendrocytes, suggesting that the phenotype might be caused by a toxic effect on oligodendrocytes and myelin, i.e. by secretion products of activated microglia/macrophages. Alternatively, it is likely that the hypomyelination results from impaired interactions between oligodendrocyte processes and axons and/or impaired morphological maturation of oligodendrocytes. Since BDV is non-cytolytic, it was suggested that BDV interferes with signaling pathways that are important for proper oligodendroglial functioning in supporting myelination and maturation of axons and axonal processes. The phosphoprotein may be responsible for this interference, possibly by competing with the phosphorylation of neurofilaments. A reduced phosphorylation state of neurofilaments will have important consequences on myelination and axonal function. Further ultrastructural studies are required to establish whether the proposed hypothesis can be confirmed.The increased number of Olig2-expressing cells in the corpus callosum of the NBAE-rats may represent a sign of proliferation and migration of oligodendrocyte precursor cells linked to remyelination. Impaired myelination can affect all brain functions, including cognition and behavior. Therefore it is possible that white matter pathology in neonatally BDV-infected rats may contribute significantly to the development of neurological disease.