Herstellung, Charakterisierung und Einsatz von Anti-Zona pellucida-Protein 2-Peptid-Antiseren

Abstract

Im Rahmen dieser Arbeit wurden Antiseren gegen synthetische ZP2­Peptide hergestellt. Die Anti­ZP2­Peptid­Antiseren wurden eingesetzt, um ZP2­Protein immunbiochemisch und immunhistologisch zu identifizieren. Desweiteren wurden die Antikörper zum Nachweis funktionell relevanter Domänen des ZP2­Proteins verwendet. Synthetische ZP2­Peptide wurden anhand bekannter molekularbiologisch isolierter cDNA­Stränge und den daraus abgeleiteten minosäuresequenzen hergestellt. Nach Auswahl und Synthese von ZP2­Aminosäuresequenzen, die entweder humanspezifisch oder speziesübergreifend (homolog) sind, konnten in Kaninchen hochtitrige Antiseren generiert werden. Die Anti­ZP2­Peptid­Antiseren AS ZP2­20 und AS ZP2­21 (Antigen: homologes ZP2­Peptid) sowie AS ZP2­26 und AS ZP2­27 (Antigen: humanes ZP2­Peptid) erkennen im ELISA das jeweilige ZP2­Peptid, das als Antigen eingesetzt wurde. Bei der Bestimmung der ZP2­Antikörpertiter gegen ihr synthetisches Peptid zeigt sich titrationsabhängig der Gehalt an spezifischen Anti­ZP2­Antikörpern gegenüber den Präimmunseren, wobei keine Kreuzreaktionen der Anti­ZP2­Peptid­Antiseren mit anderen Peptiden festzustellen waren. Mit Hilfe der Anti­ZP2­Antikörper wurde das Zona pellucida­Protein 2 (ZP2) auf Paraffinschnitten aus den Ovarien von Rind, Mensch, Schwein, Maus, Meerschweinchen und Ratte identifiziert. Die immunhistochemischen Untersuchungen zeigen, daß AS ZP2­20 Zona pellucida­Protein in Ovarien aller untersuchten Spezies detektiert. Nach Einsatz von AS ZP2­21 kommt es zu einer Immunreaktion mit Zona pellucida­Proteinen von Rind, Mensch und Maus. Obwohl AS ZP2­26 gegen ein humanes ZP2­Peptid gerichtet ist, reagieren die Antikörper mit Zona pellucida­Proteinen im humanen, bovinen und porcinen Ovar. Zona pellucida­Proteine von Nagetierovarien werden nicht erkannt. AS ZP2­27 markiert ausschließlich Zona pellucida­Protein im humanen Ovar. Die entsprechenden Präimmunseren führen zu keiner Anfärbung in den getesteten Ovarien. Diese Ergebnisse zeigen, daß Antiseren gegen synthetische ZP2­Peptide auch mit Zona pellucida­Protein reagieren. Durch Immuno­Blots mit Anti­ZP2­Peptid­Antiseren und extrahierten bovinen Eizellproteinen konnte demonstriert werden, daß die Antiseren AS ZP2­20 und AS ZP2­26 mit breiten, immunreaktiven Proteinbanden mit identischen apparenten Molekularmassen (70­80kDa) reagieren. Diese Ergebnisse bestätigen die Literaturangaben, in denen das bovine ZP2­Protein als ein Glykoprotein mit einer Masse von 70­80kDa beschrieben wird. Mit Hilfe des Hemizona­Antikörper­Bindungstests konnte nachgewiesen werden, daß AS ZP2­20­ und AS ZP2­26­Antikörper an natives, biochemisch nicht modifiziertes Zona pellucida­Protein von Rind, Mensch und Schwein binden. Im Vergleich zu den mit Präimmunseren behandelten, korrespondierenden Hemizonae kommt es zu einer deutlichen Immun­Peroxidase­Reaktion der mit Anti­ZP2­Peptid­Antikörper behandelten Test­Hemizonae. Der bovine Kompetitions­Hemizona­Assay wurde als In vitro­Testsystem zur Identifizierung funktionell relevanter Domänen eingesetzt. Nach Einsatz von Antiserum AS ZP2­20 konnte ein ZP2­Protein­Epitop identifiziert werden, das sehr wahrscheinlich für die Spermatozoen­Zona pellucida­Bindung von Bedeutung ist. Im Vergleich zu Kontrollseren (AS ZP2­26 und Präimmunseren) ist nach Vorbehandlung der Hemizonae mit AS ZP2­20­Antikörpern die Anzahl der gebundenen Spermatozoen um etwa die Hälfte herabgesetzt. Die hier vorgestellten Untersuchungen zeigen, daß Antikörper gegen synthetische ZP2­Peptide als spezifische Marker für ZP2­Protein eingesetzt werden können. Außerdem sind Antikörper gegen definierte ZP2­Protein­Domänen als Hilfsmittel für Untersuchungen physiologischer Abläufe der Spermatozoen­Eizell­Interaktion geeignet.