Herstellung, Charakterisierung und Einsatz von anti-Zona pellucida Protein 3 Peptidantiseren

Abstract

Zielstellung dieser Arbeit war die Herstellung von polyklonalen Antikörpern gegen synthetische Peptide des Zona pellucida 3 Proteins. Aus den veröffentlichten ZP3- Aminosäuresequenzen der Maus, des Menschen und des Hamsters wurden verschiedene Teilsequenzen ausgewählt und die entsprechenden Peptide synthetisiert. Zum einen wurde eine mausspezifische Teilsequenz (ZP3-2), zum anderen zwei bei Maus, Mensch und Hamster homologe Sequenzen (ZP3-5 und ZP3-6) ausgewählt. Im Rahmen dieser Arbeit wurden drei anti ZP3 Peptidantiseren charakterisiert und eingesetzt: das mausspezifische Antiserum AS ZP3-2 und die Antiseren AS ZP3-5 und AS ZP3-6, die jeweils homologe Domänen bei Maus, Mensch und Hamster darstellten. Die gewonnenen Antiseren wurden im ELISA, in der Immunhistochemie, in der Immunfluoreszenz und im Immunoblot charakterisiert. Im ELISA konnte eine titrationsabhängige Antigenerkennung der gewonnenen Antiseren und der affinitätchromatographisch gewonnenen Antikörper nachgewiesen werden. In der Immunhistochemie erfolgte der Einsatz der Antiseren an fixierten Ovargewebe-schnitten verschiedener Spezies. Während das mausspezifische Antiserum AS ZP3-2 ausschließlich mit der Zona pellucida der Mauseizelle reagierte, detektierte das Antiserum AS ZP3-5, das gegen eine homologe ZP3 Peptidsequenz gerichtet ist, die Zona pellucida bei Maus, Ratte, Hamster, Rind und in geringem Maß auch die Zona pellucida des Menschen. Bei der Eizelle des Schweines war eine außerordentlich kräftige Reaktion im Ooplasma der Eizelle zu erkennen, während sich die Zona pellucida nur schwach anfärben ließ. Ein weiteres Antiserum, das gegen eine homologe ZP3 Aminosäuresequenz gerichtet ist, AS ZP3-6, erkannte die Zona pellucida der Mauseizelle und der menschlichen Eizelle. Das Antiserum AS ZP3-6 wurde weiterhin an humanen Hemizonae von Metaphase II Eizellen mit Spermatozoen oder ohne vorherige Bindung von Spermatozoen eingesetzt. Nach Inkubation mit dem Antiserum war an allen Hemizonae eine deutliche Immunantwort nachzuweisen. Hierbei war hinsichtlich der Bindung der Antikörper an das ZP3 Protein qualitativ und quantitativ kein Unterschied feststellbar. Mittels der indirekten Immunfluoreszenz konnte gezeigt werden, daß die Antiseren auch natives, nicht denaturiertes Zona pellucida Protein erkennen. Antiserum AS ZP3-5 zeigte an der humanen und porcinen Zona pellucida eine kräftige Immunfluoreszenzmarkierung und eine deutlich schwächere im Zentrum der Eizelle. Im Vergleich zu AS ZP3-5 stellte Antiserum AS ZP3-6 die Zona pellucida sowohl der humanen als auch der Schweine Eizelle als eher schmalen Fluoreszenzring dar. Die qualitativen Unterschiede weisen auf eine unterschiedliche Zugänglichkeit der durch die Antikörper detektierten ZP3 Epitope hin. Im Immunoblot erkannte das Antiserum AS ZP3-5 Maus Zona pellucida Protein als eine breite und ausgezogene Bande im Molekularmassenbereich von 80 kDa. Antiserum AS ZP3-5 reagierte mit einem 220 kDa Schweine Zona pellucida Protein. Unter reduzierenden Bedingungen kam es zur Aufspaltung in ein 70 kDa und 53 kDa Fragment. Nicht erkannt wurden die partiell deglykosilierten Schweine Zona pellucida Proteine ZP3a und ZP3b. Das Antiserum AS ZP3-6 erkannte im Immunoblot keine Schweine Zona pellucida Proteine. Das gegen Schweineoozyten gerichtete Antiserum AS PO zeigte bei porcinen Zonae pellucidae und Zona pellucida freien Schweineeizellen ein ähnliches Proteinbandenmuster wie das Antiserum AS ZP3-5. Die hier vorgestellten Untersuchungen zeigen, daß Antikörper gegen synthetische Zona pellucida Peptide als spezifische Marker für Zona pellucida Protein eingesetzt werden können. Im Rahmen dieser Arbeit ist es zum ersten Mal gelungen, durch Antiseren gegen homologe Aminosäuresequenzen des ZP3 auch ZP3 Proteine aus Spezies, deren ZP3 Aminosäuresequenz nicht bekannt ist, zu identifizieren und zu lokalisieren.