Der Einfluß von Metaboliten auf die Proliferation von Novikoff-Hepatoma Tumorzellen : eine in vivo Untersuchung an CD Ratten

Abstract

Während der Tumorentstehung kommt es durch die Dimerisierung der Pyruvatkinase zu einem relativen Stop der Glykolyse. Gleichzeitig wird in diesen Zellen die Glutaminolyserate erhöht. Die Zielsetzung der vorliegenden Dissertation war es, in diesem Zusammenhang zu untersuchen, ob durch die kontinuierliche Perfusion mit Fructose-1,6-P2 (FBP), Aminooxyessigsäure, Cisplatin, Glycerat-3-P bzw. Bernsteinsäure-monomethylester den Tumorstoffwechsel beeinflusst und das maligne Wachstum gehemmt wird. Bekanntlich hemmt Aminooxyessigsäure direkt die Glutamat-Oxalacetat-Transaminase, Bernsteinsäure-mono-methylester, ein synthetisches Analogon von Glutamin, interferiert mit der Glutaminolyse. Glycerat-3-P wird durch proliferierende Zellen in Serin umgewandelt. Serin und FBP haben ihrerseits die Fähigkeit die M2-PK aus der inaktiven dimeren Form in die aktive tertramere Struktur umzuwandeln. Cisplatin wurde als eine Vergleichssubstanz eingesetzt. Die Kontrollgruppe wurde mit NaCl perfundiert. Als Tumor-Zellmodell dienten mit Novikoff Hepatoma (NH) Zellen injizierte CD Ratten. Die Zellen wurden in zufällig gewählten Tieren intraperitoneal passagiert, und es wurden anschliessend jeweils 1x106 NH-Zellen pro Ratte in den rechten Glutaeus maximus injiziert. Vorversuchen hatten gezeigt, dass in Zellkultur passagierte Zellen ihre Malignität verloren hatten. Nach dem Auftreten von Tumoren wurden die Tiere randomisiert und für durchschnittlich 9-10 Tage über einen Jugularis-Katheter kontinuierlich mit den jeweiligen Substanzen perfundiert. Hierbei wurde täglich die Tumorgrösse mittels einer Schublehre gemessen und hieraus ihr Volumen (cm3) berechnet. Am Ende der Versuche wurde der Tumor herauspräpariert und mittels Wasserverdrängung ihr Volumen (ml) bestimmt und die Anzahl der Metastasen und ihr Volumen bestimmt. Zusätzlich wurde in einem weiteren Versuch aus den Blutproben der Tiere ermittelt, ob die verwendeten Substanzen eine immunmodulatorische Wirkung auf die natürlichen Killerzellen zeigten und ihre Aktivität beeinflussten. Hierfür wurde der Zyto Tox 96® Test verwendet. Die Tiere, welche mit FBP behandelt wurden, zeigten im Verlauf ein geringeres Wachstum der Tumoren, ein geringeres Tumorendvolumen und es kam zu einer signifikant geringeren Metastasenbildung gegenüber den Kontrolltieren, die mit NaCl perfundiert worden waren. Somit scheint FBP von allen übrigen hier untersuchten Substanzen am potentesten den Tumorstoffwechsel zu beeinflussen. Für Aminooxyessigsäure, Bernsteinsäuremonomethylsäure und Glycerat-3-P konnte gezeigt werden, dass die Tumorendvolumina (ml) am Ende des Versuchs signifikant kleiner waren. Auch der geringere Nachweis von makroskopischen Metastasen zeigt, dass sie den Stoffwechsel der Novikoff Hepatoma beeinflussen. Für Cisplatin zeigte unter der angewandten Dosierung (5 µg) keine Wirkung auf das Tumorwachstum. Für FBP und Aminooxyessigsäure konnte zudem eine immunmodulatorische Wirkung auf die Natürlichen-Killerzellen (NK) nachgewiesen werden. Die NK zeigten im Zyto Tox 96® Test eine deutlich höhere Lyserate der Novikoff Zellen. During tumorigenesis dimerization of pyruvate kinase can lead to a termination of gly-colysis. This phenomenon is paralleled by a rise in cellular glutaminolysis. In this con-text, the aim of the presented study was to investigate whether a continuous perfusion with fructose 1,6-P2 (FBP), aminooxyacetic acid, cisplatin, glycerat-3-P or 'Bernstein-säure-monomethylester' (BME) could alter tumor metabolism and inhibit malignant growth. It is known that aminooxyacetic acid has a direct inhibitory effect on glutamate-oxalacetate-transaminase(GOT). BME, a synthetic analogue to glutamine can interfere with glutaminolysis. Proliferating cells metabolize glycerat-3-P to serine. Serine and FBP in turn have the capacity to convert M2-PK from its inactive dimeric conformation to the active tetrameric form. CD rats, inoculated with Novikoff Hepatoma (NH) cells served as tumor model. Cisplatin was used as a reference substance and saline as control. After intraperitoneal passage in randomized animals, a total of 1x106 NH cells having undergone prior peritoneal passage were injected into the right major gluteus muscle. In pretrials we had established that the cell culture passage of NH cells voided them the ability for malignant growth. After suc-cessful tumor inoculation, animals were randomly distributed to treatment groups re-ceiving either a continuous perfusion of the respective trial substance via jugular cathe-terization for an average of 9-10 days or saline. During this time daily tumor measure-ments with a caliper were performed to calculate tumor volume. At the study endpoint, tumors were dissected, tumor volume was calculated measuring water displacement and the total number of visible metastasis was documented. Additionally, blood samples were taken to investigate possible immunomodulatory effects of the treatment substances on the activity of natural killer (NK) cells using the Zyto Tox 96® kit. During the course of the continuous perfusion, animals receiving FBP showed a marked reduction of tumor growth and tumor volume at the study end point. Furthermore, a sig-nificant reduction of metastasis was seen in the FBP group compared to control animals receiving saline. Of the investigated substances, FBP was most potent in altering tumor metabolism. Additionally, it could be shown that aminooxyacetic acid, BME and glycerat-3-P were all able to significantly reduce tumor volumes. These findings were paralleled by a reduction in total metastasis, confirming the hypothesis that the investi-gated substances were able to influence the Novikoff cell metabolism. Interestingly, cis-platin the standard reference substance, showed no effect on tumor growth in the applied dose (5µg). Both FBP and amino acetic acid had immunostimula-tory effect on NK cells, augmenting the rate of Navikoff cell lysis mediated through NK cells in the Zyto Tox 96® test.