Elektrophysiologische Charakterisierung und pharmakologische Blockade von Listeriolysin O-induzierten Membranporen

Abstract

Listeriolysin O (LLO), ein porenbildendes Toxin aus der Gruppe der Cholesterolabhängigen Zytolysine (CDTX), ist ein essentieller Pathogenitätsfaktor des humanpathogenen Bakteriums Listeria monocytogenes.In dieser Arbeit konnte elektrophysiologisch direkt nachgewiesen werden, dass Dithiotreitol (DTT) und saure (5,9) pH-Werte die porenbildende Aktivität von LLO um das 3-5fache steigern. Offene LLO-Poren schliessen in der Whole-Cell Messkonfiguration gleich häufig schnell oder langsam. Nominell Ca2+-freie Intrazellulärlösung führte zu einer signifikanten Abnahme langsamer Porenschlüsse, zugunsten schneller Porenschlüsse. In den Outside-Out Patches sind beide Formen des Porenschlusses hochsignifikant seltener, wobei langsame Porenschlüsse signifikant seltener sind als statistisch im Vergleich zu den schnellen Porenschlüssen zu erwarten ist. Dies passt gut zu der Hypothese, dass es sich bei den langsamenPorenschlüssen um Endozytose-Prozesse handelt. In Inside-Out Patches konntedirekt gezeigt werden, dass LLO in der zytoplasmatischen Seite der ZellmembranPoren induzieren kann, was bei der interzellulären Ausbreitung von L.monocytogenes von entscheidender Bedeutung ist. Im Rahmen eines Screeningsauf Poren-blockierende Substanzen konnte gezeigt werden, dass die LLO-Porendurch trivalente Ionen, wie Lanthanoide und Aluminium vollständig blockiertwurden. Es handelte sich hierbei um einen vom Ionenradius abhängigen,reversiblen und membranpotentialabhängigen Block. Die zweiwertigen Metall-Ionen, wie Cd2+, Ni2+, Ru2+ und Zn2+ blockierten die LLO-induzierten Porenströme nur teilweise. Eosin Y war der einzige nicht-metallische Blocker der LLO-Poren. LLO-induzierte Ca2+-Oszillationen wurden durch Gd3+ vollständig blockiert. Im Gegensatz dazu konnten Inhibitoren der intrazellulären Ca2+-Freisetzung oder von Ca2+-Kanälen die Ca2+-Oszillationen nicht verändern. Dies zeigt, dass der Anstieg der intrazellulären Ca2+-Konzentration bei den LLO-induzierten Ca2+-Oszillationenallein durch die LLO-Poren bedingt ist. Die Blockade der plasmamembranständigen Ca2+-ATPasen (PMCA) durch Gd3+ führt zur HemmungCa2+-Sequestration bei LLO -induzierten Ca2+-Oszillationen. Das unterstreicht die entscheidende Rolle der PMCA bei den LLO-induzierten Ca2+-Oszillationen. Listeriolysin O is a pore-forming toxin belonging to the familiy of cholesteroldependent cytolysins and is the major pathogenicity factor of L. monocytogenes. By electrophysiological measurement studies, it could be directly shown that dithiotreitol (DTT) and acidic (5.9) pH raise LLOs pore-forming activity 3 to 5 fold. In whole-cell measurements LLO-pores close equally often in a quick or slow way. Ca2+-free intracellular medium leads to a significant decrease in slow closings in favour of fast closings. In outside-out patches both types of pore closings were significantly decreased compared to whole-cell measurements. Compared to the quick closings the slow closings were furthermore significantly reduced. This observation favours our hypothesis that slow closings are caused by endocytosis. As clearly shown in the above study, pore formation in inside-out patches proves that LLO can form pores in the cytoplasmatic leaflet of the cell membrane which underlines its importance in cell-to-cell spreading. On screening several substances for pore blocking abilities, we found several of them that could block the LLO-pores. The trivalent ions like lanthanoids and aluminium blocked the LLO-pores completely. This block induced by lanthanoid was fully reversible and voltage dependent. The IC50 of lanthanoids was dependent on its ionic radius. Divalent ions like cadmium, nickel, zinc and ruthenium only partially blocked the current evoked by LLO-pores. Eosin Y could be identified as a non-metal pore blocking agent.LLO induced Ca2+-oscillations were completely blocked by Gd3+ whereas blocking the intracellular Ca2+-release or Ca2+-channels did not lead to any changes. This clearly shows that the Ca2+-influx exclusively goes through the LLO-pores. Gd3+ also blocks plasma membrane Ca2+-ATPases thereby inhibiting Ca2+- sequestration in LLO-induced Ca2+-oscillations. This implies the importance of PMCAs in LLO-induced Ca2+-oscillations.