Elektrophysiologische Charakterisierung und pharmakologische sowie pathophysiologische Beeinflussung der durch Streptolysin O gebildeten Poren

Abstract

Streptolysin O (SLO) ist der Prototyp der großen Familie der cholesterolabhängigen Toxine und zählt zu den wichtigsten Virulenzfaktoren der Gruppe A Streptokokken. Diese ubiquitär vorkommenden Keime sind Verursacher häufiger Haut-, Weichteil-, Knochen- und Organerkrankungen. Trotz antibiotischer Therapie verlaufen generalisierte Infektionen auch heute noch zu einem hohen Prozentsatz letal. Zum ersten Mal konnte in dieser Arbeit die Porenbildung durch sublytische SLO-Konzentrationen an kernhaltigen Zellen mit Hilfe der Patch-Clamp Technik beobachtet werden. Die Porenbildung durch SLO war transienter Natur und die Poren wechselten zwischen geöffneten und geschlossenen Zuständen. Wir konnten eine elementare Grundpore mit einer Leitfähigkeit von 425 pS identifizieren und vermuten, dass Cluster von SLO-Poren in der Zellmembran zu synchronen Porenöffnungen und -schlüssen führen. Die Art der Porenschlüsse, die sich in langsame und schnelle Schlüsse unterteilen lassen, war abhängig von dem Gehalt an intra- und extrazellulärem Calcium. Zudem war die porenbildende und hämolytische Aktivität stark abhängig von der Temperatur und dem pH-Wert der Lösungen. Die Fiebersenkung und der Ausgleich einer metabolischen Azidose scheinen daher effektive Maßnahmen in der Therapie generalisierter Streptokokkeninfekte zu sein. In der vorliegenden Arbeit wurden außerdem Substanzen beschrieben, die in der Lage sind, die Zellzerstörung durch SLO zu reduzieren. Der Einsatz von Lanthan und Eosin Y in vitro führte zu einer Blockade der Porenströme bzw. einer Hemmung der Porenbildung und konnte die Zelllyse verhindern. In verschiedenen Versuchsansätzen konnte weiterhin gezeigt werden, dass SLO-Poren für Calciumionen permeabel sind. Bei niedrigen SLO-Konzentrationen führte der Calciumeinstrom in die Zellen zu nichtperiodischen Ca2+-Spikes, die von den Zellen toleriert wurden. In höheren Konzentrationen verloren die untersuchten Zellen die Kontrolle über ihre Calciumhomöostase. Die resultierende Calciumüberladung führte zur Apoptose der betroffenen Zellen. Streptolysin O (SLO) is the prototype of the large family of cholesterol-dependent toxins and one of the major virulence factors of group A Streptococci. These bacteria cause frequent infections of the skin, soft parts, bones and organs. Despite antibiotic therapy generalised infections still remain lethal to a high percentage. For the first time, we observed pore formation by sublytic concentrations of SLO in mammalian cells using the patch-clamp technique. Pore formation by SLO was transient, and the pores switched between open and closed states. An elementary pore with a conductance of 425 pS was identified. It is presumed that pore-clusters in the membrane of the cell lead to synchronized pore openings and closures. The kinetics of pore closure, consisting in slow and fast closings, were dependent on the intra- and extracellular calcium level. The pore-forming and haemolytic activity of SLO was highly dependent on the temperature as well as on the pH-value of the surrounding. It is presumed, that lowering of the temperature in febrile patients and creation of a physiologic acid-base-balance in patients with metabolic acidosis can contribute to the recovery from severe streptococcal infections. In the present work, we describe substances that are able to prevent cell- damage by SLO. The application of Lanthanium and Eosin Y in vitro led to a blockade of the pore current and to the inhibition of pore-formation, respectively, and avoided cell-lysis. SLO-formed pores were permeable for calcium ions, as could be shown in different experimental set-ups. With low toxin concentrations, the flux of calcium ions into the cell led to non-periodic Ca2+-spikes, which was tolerated by the cells. With higher SLO-concentrations, the investigated cells lost control about their calcium-homeostasis. The resulting calcium-overload led to the induction of apoptosis in the observed cells.