Real-Time PCR : Optimierung und Evaluation, Etablierung von Housekeeping-Genen und die Expressionsanalyse bei Fallotscher Tetralogie

Abstract

Die quantitative Real-Time PCR hat sich als eine etablierte, präzise und sensitive Methode zur Genexpressionsanalyse erwiesen. Alle Schritte der Probenaufbereitung von der Probengewinnung bis zur Real-Time PCR stellen jedoch potentielle Quellen methodischer Fehler dar. Die RNA-Isolierung und insbesondere die Reverse Transkription konnten in dieser Arbeit als Hauptverursacher der methodischen Fehler identifiziert werden. Die Protokolle wurden optimiert, um solche methodischen Fehler zu minimieren, die sich auf verschiedene Gene in verschiedenem Maße auswirken (genspezifische methodische Fehler). Die Anwendung eines validen Protokolls ist essentiell, da diese genspezifischen Fehler im weiteren Verlauf der Genexpressionsanalyse nicht mehr ausgeglichen werden können. Die Verwendung eines Housekeeping-Gens als Referenz für die Expression des zu untersuchenden Zielgens stellt eine Möglichkeit dar, solche methodische Fehler zu kompensieren, die auf alle Gene gleich wirken (globale methodische Fehler). Die Validität dieses Vorgehens steht und fällt jedoch mit des Validität der Housekeeping-Gens, das in allen untersuchten Proben möglichst konstant exprimiert sein muss. Bei der Evaluation von potentiellen Housekeeping-Genen müssen jedoch genau diejenigen globalen methodischen Fehler berücksichtigt werden, die das Housekeeping-Gen später kompensieren soll. Es wurde daher ein neues Protokoll etabliert, um einzelsträngige cDNA präzise zu quantifizieren. Der Gesamt-cDNA-Gehalt der einzelnen Proben diente bei der Evaluation von zehn potentiellen Housekeeping-Genen als Bezugspunkt, um globale methodische Fehler auszugleichen. 18S, PBGD und CASQ2 konnten für die untersuchten Myokardproben von Patienten mit Fallotscher Tetralogie (TOF) als valide Housekeeping-Gene identifiziert werden. Für die Real-Time PCR selbst konnte die Sensitivität und Präzision der Methode auch für extrem niedrige Konzentrationen von bis zu einem Molekül Nukleinsäure pro Reaktion nachgewiesen werden. Dies hat direkte klinische Konsequenzen, beispielsweise bei der Diagnostik und Verlaufskontrolle der Minimal Residual Disease. Im nicht-ischämischen RV Myokard von Patienten mit Fallotscher Tetralogie konnte entgegen anders lautender Voruntersuchungen die Expression von HIF1A, VEGF und dessen Rezeptoren nachgewiesen werden. HIF1A scheint dabei auch auf mRNA-Ebene reguliert zu sein. Für die natriuretischen Peptide ANP und BNP sowie für HIF1A, VEGF und dessen Rezeptoren VEGF-R1 und VEGF-R2 konnte der in der Literatur beschriebene Altersverlauf nachvollzogen werden, wobei ein Wiederanstieg von VEGF-121 in den adulten Kontrollproben auffällig war. Vor dem Hintergrund der differenten Altersstruktur der Kontrollgruppe und der Gruppe der Patienten mit Fallotscher Tetralogie konnte die erwartete gesteigerte Expression der untersuchten Gene in den TOF-Proben nur für VEGF-R1 gezeigt werden. Für ANP und BNP zeigte sich sogar eine verminderte Expression in den TOF-Proben. Diese könnte auf den lokalen Unterdruck am Ort der Biopsieentnahme im Sinne des Bernoulli-Effekts zurückzuführen sein. Eine Abhängigkeit von klinischen Parametern wie dem rechtsventrikulären Druck oder der arteriellen Sauerstoffsättigung zeigte sich nicht. Die Korrelationen der Gene untereinander können Anlass zu Hypothesen bezüglich der Regulation dieser Gene sein. HIF1A und VEGF-189 könnten bei der Regulation der VEGF-Rezeptoren eine stärkere Rolle spielen als VEGF-121 oder VEGF-165. Außerdem könnten die natriuretischen Peptide und die angiogenetischen Wachstumsfaktoren enger miteinander verknüpft sein als bisher angenommen. Weiterführende Studien müssen die so generierten Hypothesen überprüfen. Quantitative real-time PCR is an established, precise and sensitive method for gene expression analysis. However, all steps of sample preparation from sample salvage to the final PCR reaction, are potential sources of methodical errors. RNA isolation and most importantly reverse transcription could be identified as the main reasons for methodical errors in this study. Protocols were optimized to minimize methodical errors that effect different genes to a different extend (gene-specific methodical errors). The use of a valid protocol is essential, as these gene-specific errors cannot be compensated for during further steps of the gene expression analysis. The use of a housekeeping-gene as a reference for the expression of the gene of interest represents a way to compensate for methodical errors that affect every gene to the same extend (global methodical errors). The validity of this procedure, however, depends strongly on the validity of the housekeeping-gene that has to be expressed constantly within all the samples studied. In the process of evaluating potential housekeeping-genes one has to regard exactly the same global methodical errors that are to be compensated by the housekeeping-gene later on. Therefore, a new protocol was established to precisely quantify single-stranded cDNA. The overall content of cDNA within a given sample was then used as a reference to compensate for global errors during the evaluation of ten potential housekeeping-genes. 18S, PBGD and CASQ2 could be identified as valid housekeeping-genes for the set of myocardial samples obtained from patients with Tetralogy of Fallot (TOF). Sensitivity and precision of the real-time PCR itself could be shown even for extremely low concentrations of down to one molecule of nucleic acid per reaction. This has direct clinical implications, for example during the diagnosis and monitoring of minimal residual disease. In non-ischemic right ventricular myocardium of patients with Tetralogy of Fallot, the expression of HIF1A, VEGF and its receptors could be shown in the face of contradicting studies. HIF1A appears to be regulated on the level of mRNA. For the natriuretic peptides ANP and BNP as well as for HIF1A, VEGF and its receptors VEGF-R1 und VEGF-R2 the previously described dependency of patient age could be confirmed. An increase of VEGF-121 expression in adult control samples was apparent. With the differences in the age of patients and control sample donors to regard, the expected elevated expression of the studied genes within the TOF-samples could be shown only for VEGF-R1. In the case of ANP and BNP even a significantly reduced expression could be shown within the TOF-samples. This lower expression could be caused by the locally reduced pressure at the place of sample excision according to Bernoulli. A correlation between the expression of the studied genes and clinical parameters like right ventricular pressure or arterial oxygen saturation could not be found. The correlation between the expressions of several genes with that of other genes could lead to hypotheses regarding the regulation of these genes. HIF1A and VEGF-189 could play a more important role in the regulation of VEGF receptors than VEGF-121 or VEGF-165. Also, natriuretic peptides and vascular growth factors could be more closely coregulated than previously assumed. Further studies are needed to verify or falsify these hypotheses.