Genom- und Expressionsanalyse des Hepatitis-B-Virus in Hepatozytenkulturen von Tupaia belangeri

Abstract

Ziel dieser Arbeit war es, nach einem adäquaten Modell für die HBV-Infektion zu suchen. Zum Zeitpunkt des Beginns der Doktorarbeit standen nur wenige schwer verfügbare Zellkultursysteme zur Verfügung, die sich mit Hepatitis B Virus (HBV) experimentell infizieren ließen. Die Versuche in dieser Arbeit konnten zeigen, dass die primären Tupaia-Hepatozytenkulturen ein praktikables System zur Messung der HBV-Infektiosität darstellen. Die Bereitstellung von Tupaia-Leber ist im Gegensatz zum primären humanen Hepatozytenkulturen gut planbar. Durch ihre nicht tumoröse Herkunft entspricht es den physiologischen Bedingungen im humanen Wirt. Dieses System ist somit den primären humanen Hepatozyten überlegen. Die quantitative real-time LightCycler PCR und RT-PCRs zur Detektion der replikativen Intermediate, cccDNA und der Gesamt-mRNA, in den frühen Phasen einer HBV Infektion wurde erfolgreich an infizierten primären Tupaia-Hepatozytenkulturen optimiert. In einer Kinetik der Infektion von primären Tupaia Hepatozyten konnte gezeigt werden, dass die cccDNA, welche den ersten Marker einer etablierten Infektion darstellt, bereits 18 h nach der Infektion nachgewiesen werden kann. Am siebten Tag post infektionem wurde eine eindeutige Menge an viralem Sekretionsprodukte, HBeAg und HBsAg, nachgewiesen. Das heißt, erst sieben Tage nach der Infektion mit HBV hatte sich eine vollentwickelte HBV-Infektion etabliert. Es konnte gezeigt werden, dass die Methodik der Quantifizierung von cccDNA mittels real-time PCR für den Nachweis von cccDNA auch an sehr geringen Mengen von Leberbiopsaten geeignet ist. The main point of the work was to investigate HBV infection in an adequate cell culture model. At the beginning of the work there were just only primary human hepatocytes which could be infected with hepatitis B virus in vitro. The test in this work could show that the primary tupaia hepatocyte cultures where a feasible system to measure HBV infectivity. In contrast to primary human hepatocyte cultures, hepatocytes abtrained from Tupaia livers are better available, and show less heterogeneity and increased suspectibility to HBV infection. The quantitative real-time LightCycler PCR and RT-PCRs for the detection of HBV replicative intermediates, cccDNA and full-mRNA, in esp, the early phase of the HBV infection could be successfully optimized using primary tupaia hepatocycte cultures. The kinetics of HBV infection of primary tupaia hepatocytes has shown that the first marker of an established infection, the cccDNA, could only after little as 18 hours post infectionem. At the 7th day after the infection HBeAg und HbsAg was detectable in supernatant. That means that seven day after inoculation of the cells with HBV in vitro HBV was fully established. It could be shown that the method of cccDNA quantification using real-time PCR is very usefull for the verification of cccDNA in the liver biopsies.