Überprüfung der Expression des hypophysären POMC-Gens und der Bildung und Freisetzung von hypophysären POMC-Derivaten in den Zelllinien HaCaT und Colo 679

Abstract

Über die Expression des hypophysären POMC-Gens und die Bildung und Freisetzung von hypophysären POMC-Derivaten in der Hypophyse des Menschen liegen viele Informationen vor. Psychische und physische Belastungen ("Stress") scheinen bei der Bildung und Freisetzung hypophysärer POMC-Derivate eine große Rolle zu spielen. Die in der aktuellen Literatur beschriebenen Untersuchungen zur Expression eines POMC-Gens in der Haut führten noch nicht zu eindeutigen Ergebnissen. Einige Autoren beschrieben die Expression des hypophysären POMC-Gens und die Bildung und Freisetzung von hypophysären POMC-Derivaten in den Zellen der menschlichen Haut. Neuerdings wird allerdings auch ein POMC-Gen in menschlichen Hautzellen postuliert, das sich vom POMC-Gen der Hypophyse unterscheidet ("aberrantes" POMC-Gen). Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurden Versuche durchgeführt, die einen Beitrag zur Klärung der kontroversen Datenlage bezüglich der Expression des hypophysären oder eines aberranten POMC-Gens und der Bildung und Freisetzung von POMC-Derivaten im Organsystem Haut leisten sollten. Auf der Transkriptionsebene sollte mittels RT-PCR hypophysäre POMC-mRNA in Zellen der Keratinozyten-Zelllinie HaCaT und der Melanom-Zelllinie Colo 679 nachgewiesen oder ausgeschlossen werden. Auf der Post-Translationsebene wurde versucht, hypophysäre POMC-Derivate in Zellen und Zellkulturüberständen der Keratinozyten-Zelllinie HaCaT und der Melanom-Zelllinie Colo 679 mittels RIAs nachzuweisen oder auszuschließen. Hierzu wurden auch polyklonale Antiseren und monoklonale Antikörper gegen hypophysäre POMC-Derivate produziert. Es gelang, verschiedene polyklonale Antiseren mit Antikörpern gegen hypophysäre POMC-Derivate (acetyliertes N-terminales Fragment von Gamma-MSH, acetyliertes N-terminales Fragment des Joining Peptide, C-terminales Fragment von Alpha-MSH, acetyliertes N-terminales Fragment von CLIP, C-terminales Fragment von CLIP) herzustellen, die für Folgeprojekte bereitgestellt wurden. Es konnte keine Transkription des hypophysären POMC-Gens in der Keratinozyten-Zelllinie HaCaT und der Melanom-Zelllinie Colo 679, unter Basalbedingungen oder nach versuchter Stimulation mit CRH (10-8 M), mittels RT-PCR-Versuchen mit den hier eingesetzten Primerpaaren nachgewiesen werden. Auch in nativen Keratinozyten war in orientierenden Untersuchungen der Nachweis der Transkription des hypophysären POMC-Gens mittels RT-PCR-Versuchen mit den eingesetzten Primerpaaren nicht möglich. Auf der Post-Translationsebene konnte mittels RIAs keine Bildung und Freisetzung von hypophysärem Beta-Endorphin (1-31), hypophysärem Beta-Endorphin-IRM und hypophysärem Beta-LPH-IRM in den Zellkulturüberständen und Zelllysaten der Keratinozyten-Zelllinie HaCaT und der Melanom-Zelllinie Colo 679 nachgewiesen werden. Weder unter Basalbedingungen, noch nach Zugabe des potentiellen Stimulators CRH (10-8 M) und/oder Zugabe des potentiellen Suppressors Dexamethason (10-6 M) waren die genannten POMC-Derivate nachweisbar. In einem von drei Versuchen gelang der Nachweis der Bildung und Freisetzung von N-Ac-Beta-Endorphin-IRM in den Zellüberständen und Zelllysaten der Keratinozyten-Zelllinie HaCaT. Eine Modulation der Bildung und Freisetzung von N-Ac-Beta-Endorphin-IRM durch Zugabe des potentiellen Stimulators CRH (10-8 M) und/oder Zugabe des potentiellen Suppressors Dexamethason (10-6 M) wurde nicht beobachtet. In zwei von drei Versuchen gelang der Nachweis der Bildung von N-Ac-Beta-Endorphin-IRM in den Zelllysaten der Melanom-Zelllinie Colo 679. Eine Modulation der Bildung und Freisetzung von N-Ac-Beta-Endorphin-IRM durch Zugabe des potentiellen Stimulators CRH (10-8 M) und/oder Zugabe des potentiellen Suppressors Dexamethason (10-6 M) konnte auch hier nicht nachgewiesen werden. Unsere Ergebnisse widersprechen in ihrer Gesamtheit der Hypothese der Expression des hypophysären POMC-Gens in der menschlichen Haut. Sie sind jedoch gut vereinbar mit der Hypothese der Expression eines vom POMC-Gen der Hypophyse verschiedenen, also "aberranten" POMC-Gens. The expression of pituitary POMC gene and the release of POMC-derived peptides from the human pituitary are widely described. Physiological and psychological strain ("stress") show significant influence on the release of pituitary POMC-derived peptides. Unfortunately, sufficient information about the situation in human skin is currently lacking. Some authors described the expression of the pituitary POMC gene and pituitary POMC-derived peptides in cells of human skin (Slominski et al. 1995). However, recently there is a report of a putative variant of pituitary POMC gene in human epidermis and epidermal cells (Can et al. 1998). Our investigations were intended to contribute to the information about the expression of an epidermal POMC gene. At the transcription level pituitary POMC-mRNA in the human keratinocyte cell line HaCaT and the human melanoma cell line Colo 679 should be detected or ruled out by RT-PCR. At the post-translational level, the presence of pituitary POMC-derived peptides in the human keratinocyte cell line HaCaT and the human melanoma cell line Colo 679 should be proven or disproven by RIA. In the frame of of this investigation, polyclonal antisera and monoclonal antibodies recognising pituitary POMC-derived peptides had to be generated.Such new antisera directed against pituitary POMC-derived peptides have been generated and can be utilized in further research projects. We were able to produce antisera binding to the acetylated N-terminal fragment of human Gama-MSH, binding to the acetylated N-terminal fragment of human Joining Peptide, binding to the C-terminal fragment of human Alpha-MSH, binding to the acetylated N-terminal fragment of human CLIP, and binding to the C-terminal fragment of human CLIP. The expression of pituitary POMC gene in the human keratinocyte cell line HaCaT and the human melanoma cell line Colo 679 could not be confirmed in a series of RT-PCR experiments, neither under basal conditions nor after stimulation with CRH (10-8 M). In pilot experiments using native human keratinocytes no pituitary POMC-mRNA could be detected in our RT-PCR experiments. At the post-translational level, a release of pituitary Beta-Endorphin (1-31), pituitary Beta-Endorphin-IRM or pituitary Beta-LPH-IRM into conditioned media or their presence in cells of the human keratinocyte cell line HaCaT or the human melanoma cell line Colo 679 could not be shown. Neither under basal conditions nor after cell treatment with a potential stimulator, CRH (10-8 M), and/or a potential suppressor, Dexamethasone (10-6 M), these POMC-derived peptides where detectable in RIAs. In one out of three assays we were able to detect a release of pituitary N-Ac-Beta-Endorphin-IRM into conditioned media and its presence in cells of the human keratinocyte cell line HaCaT. A previous cell treatment with a potential stimulator, CRH (10-8 M), and/or a potential suppressor, Dexamethasone (10-6 M), did not modulate production or release of this peptide. In two out of three assays we observed the presence of pituitary N-Ac-Beta-Endorphin-IRM in cells of the human melanoma cell line Colo 679. We could not provoke a modulation of the amounts of this peptide found in the cells by previous cell treatment with a potential stimulator, CRH (10-8 M), and/or a potential suppressor, Dexamethasone (10-6 M). Synopsis of our results contradicts the hypothesis of an expression of pituitary POMC gene in human skin. But, in fact, our results are coherent with the hypothesis of an expression of a putative variant of POMC gene in human epidermis (different from POMC gene in pituitary gland).