Characterization of Voltage Dependent Anion Channel (VDAC) subtypes in mammalian follicles and potential physiological relevance

Abstract

This thesis comprises the study of the expression of VDAC subtypes in porcine and bovine oocytes in GV and MII stage oocytes by means of RT-PCR. The results demonstrate that VDAC1, 2 and 3 subtypes are expressed within oocytes of both species. Subsequently, quantitative expression of VDAC1, 2 and 3 mRNA transcripts in bovine oocytes from follicles with three different diameters was determined (group 1 <3mm; group 2, 4-6mm and group 3, 8-11mm) by real-time RT-PCR. A distinct difference in the relative expression was observed only for VDAC1 which presented down-regulation of expression with a magnitude factor of 2.4 in group 3 compared to group 1. Immunoblot studies using subtype specific anti-VDAC antibodies and porcine spermatozoa indicated the presence of VDAC1, 2 and 3 in male germ cells. Further characterization of VDAC polypeptides by MALDI-TOF MS and PMF analyses of 2D-gels from hydroxyapatite-celite purified VDAC from porcine spermatozoa protein confirmed the detection of VDAC2. Functional experiments in artificial membranes showed that biochemically isolated VDAC was successfully renatured by demonstrating voltage dependent electrophysiological channel properties and a single conductance of 1.6nS. In porcine oocytes VDAC1 and VDAC2 protein expression could be demonstrated by immunoblot experiments assaying VDAC proteins that derived from GV and MII stage oocytes. A shift of intensity of protein stain as well as differences in apparent molecular masses were observed with anti-VDAC2 antibody between GV and MII stage oocytes. MALDI-TOF MS and PMF analyses confirmed the presence of VDAC2 protein in GV stage oocytes. Using specific antisera against synthetic peptide sequences from VDAC subtypes immunohistochemical data suggest the presence of VDAC 1 and 2 in ooplasm of porcine oocytes as well as in the follicle cells with no clear change of localization during folliculogenesis. Subcellular localization of VDAC1 by confocal laser microscopy exhibited a dense arrangement of particular dotted fluorescent labeling over the entire oocyte surface suggesting the presence of VDAC1 in the porcine oocyte plasma membrane. Data obtained from permeabilized oocytes assayed with anti-VDAC1 and anti-VDAC3 antibodies show a clear pattern of spotlike immunofluorescent labeling localized particularly around the cortical area in GV and MII stage oocytes. Anti-VDAC2 immunostaining yielded ring-like clusters structures distributed on the cortical area in some but not in all GV stage oocytes. Microinjection of matured porcine and bovine oocytes with VDAC protein purified from porcine spermatozoa was performed in order to detect possible oocyte activation and/or calcium oscillation activity. The results showed no clear change of oocyte activity or calcium oscillation after intraooplasmic injection of purified sperm VDAC protein. Finally, blocking VDAC1 activity in in vitro maturating bovine oocytes using anti-VDAC1 antibodies resulted in a significant interruption of physiological maturation events. These results obtained in this study are the first that show particular biochemical characteristics, distributions and possible functions of VDAC subtypes during maturation and fertilization of porcine and bovine oocytes. Ziel dieser Arbeit war es, das Vorhandensein, die Lokalisation und die mögliche funktionelle Relevanz der VDAC Isoformen VDAC 1, VDAC2 und VDAC3 in porcinen und bovinen Gameten zu untersuchen. Mit Hilfe der RT-PCR wurde die Synthese der VDAC Subtypen in porcinen und bovinen Oozyten unterschiedlicher Entwicklungsstadien (GV- und MII-Stadium) nachgewiesen. In den Oozyten beider Spezies konnte die Expression aller drei Subtypen (VDAC1, 2 und 3) detektiert werden. Zusätzlich zum qualitativen Nachweis erfolgte die quantitative Bestimmung von VDAC1, 2 und 3 mRNA-Transkipten in bovinen Oozyten mittels real-time RT-PCR. Untersucht wurden Oozyten verschiedener Follikelgrößen (Gruppe 1 <3mm; Gruppe 2, 4-6mm und Gruppe 3 8-11mm). Nur für VDAC1 wurde ein relevanter Unterschied in der relativen Expression in Form einer Herunterregulierung der Transkriptmenge in der Größenordnung eines Faktors von 2,4 in der Gruppe 3 verglichen mit der Gruppe1 beobachtet. Unter Verwendung subtypen-spezifischer anti-VDAC Antikörper gelang es mit immunbiochemischen Untersuchungsmethoden VDAC1, 2 und 3 Protein in porcinen Spermatozoenproteinextrakten nachzuweisen. Nach der Reinigung der Spernmatozoenextrakte über einen Hydroxyapatite-Celite Säule und anschließender Auftrennung in einer 2D-SDS PAGE erfolgte eine weitere Charakterisierung der gewonnenen VDAC Polypeptide mittels MALDI-TOF Massenspektrometrie und PMF-Analyse. Diese Untersuchungen bestätigten eindeutig das Vorhandensein von VDAC2 in Proteinextrakten aus porcinen Spermatozoen. Abschließende Ergebnisse zum Nachweis von VADC1 und VDAC3 liegen zurzeit noch nicht vor. Funktionelle Experimente in künstlichen Membranen (Lipid bilayer membrane) zeigten, dass aus porcinen Spermatozoen biochemisch isolierte VDAC Proteine erfolgreich renaturiert werden konnten, was sich in spannungsabhängigen elektrophysiologischen Kanaleigenschaften und einer Einzeleitfähigkeit von 1,6nS zeigte. Nach Einsatz subtypspezifischer anti-VDAC Antiseren wiesen immunhistochemische Experimente auf das Vorhandensein von VDAC1 und 2 im Ooplasma porciner Oozyten sowie in den sie umgebenden Follikelzellen, ohne sichtbare Veränderung der Lokalisation während der Follikulogenese, hin. Untersuchungen zur subzellulären Lokalisation von VDAC Protein in porcinen Oozyten wurden mittels konfokaler Laser-Mikroskopie durchgeführt. Eine homogen punktförmige Fluoreszenz an der Peripherie nicht permeabilisierter porciner Oozyten im GV-Stadium nach Verwendung von Anti- VDAC1 Antikörpern legte den Schluss nahe, dass sich VDAC1 in der Plasmamembran befinden könnte. Permeabilisierte Oozyten, die mit Anti-VDAC1 und Anti-VDAC3 Antikörpern inkubiert wurden, wiesen ein klares punktförmiges Fluoreszenzmuster, insbesondere in der kortikale Region der Oozyten im GV- und MII-Stadium, auf. Immunfärbungen mit Anti-VDAC2 Antikörpern zeigten ringartige Strukturen, konzentriert in der kortikalen Region, einiger aber nicht aller untersuchten porcinen Oozyten im GV-Stadium. Auch in immunbiochemischen Experimenten (SDS-PAGE und Immunoblot) wurden VDAC1 und VDAC2 Proteine in porcinen GV- und MII-Oozyten nachgewiesen. Dabei wurde eine Veränderung in der Immunreaktivität beobachtet und gleichzeitig erfolgte ein Shift einer Proteinbande von 30kDa in Oozyten im GV-Stadium zu 50kDa in Oozyten im MII-Stadium nach Einsatz von Anti- VDAC2 Antikörper. Durch die MALDI-TOF Massenspektrometrie und PMF-Analyse wurde das Vorhandensein von VDAC2 in porcinen Oozyten im GV-Stadium bestätigt. In Experimenten zur funktionellen Relevanz von VDAC in Säugetiereizellen, wurden aus porcinen Spermatozoen aufgereinigte VDAC-Proteine in maturierte porcine und bovine Oozyten injiziert (intraooplasmatische Injektion). Die Ergebnisse dieser Untersuchungen zeigten, dass keine Eizell-Aktivierung ausgelöst bzw. eine Veränderung der Kalziumoszillationen beobachtet werden konnte. Schließlich wurde durch die Inkubation von maturierten bovinen Oozyten mit Anti-VDAC1 Antikörpern eine signifikante Verzögerung von physiologischen Maturierungsvorgängen erreicht. Das lässt den Schluss zu, das VDAC1 in diesem Prozess involviert sein könnte und durch die Antikörper zumindest partiell funktionell blockiert wurde. Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigen erstmals konkrete biochemische Charakteristika sowie eine spezifische Lokalisation von VDAC Subtypen in porcinen und bovinen Oozyten und geben erste Hinweise auf eine mögliche Funktion von VDAC1 während der Maturation in bovinen Oozyten.