Synthese von Melanin und Pityriacitrin bei Exophiala dermatitidis : ein Vergleich zweier UV-protektiver Substanzen

Abstract

Durch Zugabe von Tryptophan als alleiniger Stickstoffquelle zu einem Minimalagar konnten Mayser et al. den Hefepilz M. furfur zur Bildung von Pigmenten und Fluorochromen anregen. Es wurde eine neuartige chemische Verbindung isoliert und erstmalig beschrieben, welche einen komplexen UV-Filter darstellt. Das Indolderivat mit der Summenformel C20H13N30 wurde Pityriacitrin genannt (Mayser et al. 1998; Mayser et al. 2002). Nachdem phylogenetisch weit entfernte Pilze ebenfalls zur Pigmentproduktion angeregt werden konnten (Nies, 2006), vermuteten Mayser et al., dass der in der internationalen Literatur gut untersuchte melaninbildende Wildstamm des Schwärzepilzes Exophiala dermatitidis P202 (ATCC No. 34100) zwei verschiedene UV-Filtersysteme in seinem Genom verankert haben könnte: Melanin und die durch den neu beschriebenen Stoffwechselweg produzierten Substanzen. Durch Bestrahlung von Exophiala dermatitidis P202 und einer melaninlosen weißen Mutante Exophiala dermatitidis P201 (ATCC No. 44504) mit UVA und UVB sollten die UV-filternden Eigenschaften der neu beschriebenen Substanzen herausgestellt und mit der des Melanins verglichen werden. Die Pigmentbildung von Exophiala dermatitidis P202 wurde nach Kultivierung auf tryptophanhaltigem Minimalagar dünnschichtchromatographisch und durch die HPLC (high liquid performance chromatography) untersucht. Die pigmentbildenden Eigenschaften von P201 konnten bereits von Nies 2006 nachgewiesen werden. In 6 Einzelversuchen wurden P201 und P202 jeweils 6 Tage auf tryptophanhaltigem Minimalagar zur Bildung von Pigmenten angeregt und ebenfalls 6 Tage auf nährstoffreichem Selektiv Agar für pathogene Pilze ohne Bildung dieser Pigmente kultiviert. Die Pilze wurden abgeerntet, seine Zellen ausgezählt und in standardisierten Mengen nochmals auf Selektiv Agar weiterverimpft. Auf diesen Agarplatten wurden die Kolonien anschließend mit UVA 100, 150, 200 und 250 mJ / cm2 bzw. mit UVB 500, 1000, 1500, 2000 mJ / cm2 in einmaliger Dosis unter standardisierten Bedingungen in vitro bestrahlt. Nach 5 weiteren Wachstumstagen konnten die Pilzkolonien abgeerntet werden. Das Trockengewicht der Pilzzellen wurde bestimmt und mit Hilfe von Eichkurven in die Zellzahl umgerechnet. Die Studie ergab folgende Ergebnisse: · In dieser Studie konnte erstmals nachgewiesen werden, das Exophiala dermatitidis P202 unter bestimmten Voraussetzungen in der Lage ist, zwei unterschiedliche UV-Filter zu synthetisieren (Melanin und Pityriacitrin). Die Induzierbarkeit des neu beschriebenen Stoffwechselwegs konnte ebenfalls bei Exophiala dermatitidis P201 bestätigt werden. Bei Melanin und den gebildeten Indolderivaten konnte jeweils ein UV-Schutz bestätigt werden. · Melanin tritt als permanenter UV-Filter in den Vordergrund, wobei der von Mayser et al. neu beschriebene Stoffwechselweg - und damit auch die Produktion von Pityriacitrin - nur durch Wachstum des Pilzes unter Mangelbedingungen auf Minimalagar und der Zugabe von Tryptophan als alleinige Stickstoffquelle induzierbar ist. · Die in vitro Versuche konnten zeigen, das Melanin den potenteren UV-Filter im Bereich von UVA- und UVB-Strahlung darstellt. Eine Kombination beider UV-Filter zeigt einen schlechteren UV-Schutz bei steigenden Intensitäten, gefolgt von dem UV-Schutz durch die Indolderivate. Das schlechteste Wachstum nach UV-Bestrahlung zeigte der Pilz ohne UV-Schutz. · Die UV-Filter zeigten keinen synergistischen oder additiven Effekt. Ein konkurrierendes Verhalten in der Synthese beider Systeme lässt sich vermuten. · Bei dem von Mayser et al. neu beschriebenen Stoffwechselweg lässt sich aufgrund seines breiten UV-Absorptionsspektrums und besonders der Fähigkeit im Bereich von UVC-Strahlung zu absorbieren, ein phylogenetisch sehr alter Stoffwechselweg vermuten, der bis auf das Erdzeitalter des Archaikums zurückzuführen sein könnte. · Bisher ist keine natürliche Situation beschrieben worden, in der Exophiala dermatitidis den zweiten Stoffwechselweg anwendet. Es scheint zu einem sehr alten Genom zu gehören, welches dem Pilz in der heutigen Zeit keine bisher bekannten Vorteile bringt. · Künftige Studien könnten sich mit Pityriacitrin als möglichen Pathogenitätsfaktor befassen. Bei der Dermatomykose Pityriasis versicolor lässt sich eine Rolle von Pityriacitrin in M.furfur als Pathogenitätsfaktor nicht vollständig ausschließen (Machowinski et al. 2006). Weiter gewinnt die Erforschung von UVC-Filtern, wie dem Pityriacitrin, bei fortschreitender Abnahme der Ozonschicht immer mehr an Bedeutung. Auch könnten über zusätzliche Forschungen hinsichtlich der Minimierung von Reactive Oxygen Spezies (ROS) durch Pilze mit oben beschriebenem Stoffwechselweg nachgedacht werden. By addition of tryptophan as sole nitrogen source to minimal agar Mayser et al. induced the formation of pigments and fluorochromes in the yeast fungus M. furfur. A new chemical compound with complex UV filter properties was isolated and described for the first time. The indole derivative with the chemical formula C20H13N30 was called pityriacitrin (Mayser et al. 1998; Mayser et al. 2002). After phylogenetically far distant fungi could also be stimulated to produce pigment (Nies, 2006), MAYSER et al. assumed that the melanin-forming wild strain of the black mold Exophiala dermatitidis P202 (ATCC No. 34100), which is well described in the international literature, might have a genomic anchoring of two different UV filter systems: melanin and the substances produced by the newly detected metabolic pathway. By UVA and UVB irradiation of wild-type strain Exophiala dermatitidis P202 and a melaninless white mutant Exophiala dermatitidis P201 (ATCC No. 44504) the UV filter properties of the newly described substances were demonstrated and compared with those of melanin. Following cultivation on tryptophan-containing minimal agar, the formation of pigment by Exophiala dermatitidis P202 was investigated by thin-layer chromatography and high performance liquid chromatography. Pigment production by P201 was already demonstrated by Nies (2006). In 6 individual trials running for 6 days each, P201 and P202 were stimulated to produce pigment on tryptophan-containing minimal agar and, on the other hand, cultivated on nutritious selective agar for pathogenic fungi without pigment formation. The molds were harvested, the cells were counted and inoculated at standardized amounts onto selective agar. The colonies on these agar plates were then irradiated with single doses of UVA 100, 150, 200 and 250 mJ / cm2 or UVB 500, 1000, 1500, 2000 mJ / cm2 at standardized conditions in vitro. After another 5 days of growth the colonies were harvested. The dry weight of the fungal cells was determined and converted to cell number by means of calibration curves. The study revealed the following results: · It was shown for the first time that under certain conditions Exophiala dermatitidis P202 is able to synthesize two different UV filters (melanin and pityriacitrin). The inducibility of the newly described metabolic pathway was also confirmed in Exophiala dermatitidis P201. UV protection was evidenced for melanin and the produced indole derivatives. · Melanin predominates as a permanent UV filter, whereby the newly described pathogenic pathway and thus also the production of pityriacitrin is only inducible by fungal growth under deficient conditions on minimal agar and addition of tryptophan as sole nitrogen source. · The in vitro trials showed that melanin as a UV filter is more potent in the UVA and UVB range. Combination of both UV filters results in poorer UV protection at increasing intensities, followed by UV protection by the indole derivatives. Without UV protection the fungus showed poorest growth after UV irradiation. · The UV filters had no synergistic or additive effect. A competiting behavior of both systems may be assumed. · Because of its broad UV absorption spectrum and especially its ability to absorb radiation in the UVC range the novel metabolic pathway described by Mayser et al. is thought to be a phylogenetically very old metabolic pathway which might be retraceable back to the archaic era. · To date, no natural situation has been described in which Exophiala dermatitidis uses the second metabolic pathway. It seems to belong to a very old part of the genome which does not offer the fungus known advantages in this day and age. · Future studies should investigate pityriacitrin as a potential pathogenicity factor. It cannot be completely excluded that pityriacitrin in M.furfur plays a pathogenetic role in the dermatomycosis pityriasis versicolor (Machowinski et al. 2006). Furthermore, exploration of UVC filters such as pityriacitrin might become increasingly important with persistent degradation of the ozon layer. Finally, further studies could be performed in terms of minimizing reactive oxygen species (ROS) by fungi using the abovementioned metabolic pathway.