Die Expression des Transkriptionsfaktors Cbfa1 von osteo-kartilaginärem Gewebe in vitro in Abhängigkeit von Zellpassage und Kultivierungsmethode

Abstract

Chondrozyten sind in entscheidendem Maße abhängig von der sie umgebenden extrazellulären Matrix. In gesundem Gelenkknorpel bleiben sie phänotypisch stabil und zeigen keine wesentlichen Differenzierungsvorgänge. Entzündliche, traumatische oder generativ bedingte Veränderungen der extrazellulären Matrix führen hingegen zu Änderungen sowohl im Phänotyp als auch im Expressionsverhalten knorpeltypischer Matrixproteine der Chondrozyten. Auch in-vitro ist diese Abhängigkeit der Chondrozyten von der Umgebungsmatrix zu beobachten. Während sie unter dreidimensionalen Kulturbedingungen anhähernd phänotypisch und im Expressionsverhalten gesunden Chondrozyten in-vivo entsprechen, kommt es in der zweidimensionalen Monolayerkultur zu einem fibroblastenartigen Aussehen mit einem veränderten Kollagen-Expressionsmuster. Cbfa1 ist ein essentieller Transkiptionsfaktor der osteo-kartilaginären Zellreihe. Das Fehlen, bzw. Mutationen dieses Transkriptionsfaktors gehen einher mit erheblichen Störungen in der Skelettentwicklung. Auch im Rahmen der Knorpelentwickung, insbesondere bei der Ausbildung hypertropher Chondrozyten der enchondralen Ossifikation besitzt dieses Gen eine zentrale Rolle. Mit der vorliegenden Arbeit wurde das Expressionsverhalten von Cbfa1 in unterschiedlichen Zellen der osteo-kartilaginären Zellreihe untersucht. Besonderes Augenmerk wurde hierbei auf den Einfluss der Kultivierungsmethode auf die Cbfa1-Expression von humanen Gelenkchondrozyten gerichtet. Zunächst konnte gezeigt werden, dass sowohl in Osteoblastenzelllinien, als auch in unterschiedlichen Osteosarkomzelllinien und in Chondrozyten (Monolayerkultur) Cbfa1-RNA nachweisbar ist. Vor dem Hintergrund der Dedifferenzierungsphänomene kultivierter Chondrozyten wurde nachfolgend die Cbfa1-mRNA-Expression frisch isolierter Chondrozyten verglichen mit bereits in der Monolayerkultur passagierten Zellen mittels quantitativer PCR. Hier zeigte sich nach Passagierung in der Monolayerkultur ein deutlicher Anstieg der Cbfa1-RNA-Expression. Dieses hohe Expressionsniveau war auch nach mehrfachen Passagierungen im Monolayer nachweisbar. Im nächsten Schritt wurde die Cbfa1-RNA-Expression unter verschiedenen Kulturbedingungen untersucht: Die frisch isolierten Chondrozyten wurden zum einen in der Monolayer und zum anderen in der Alginatkultur kultiviert. Nach 14 Tagen wurde erneut die Cbfa1-RNA-Expression untersucht. Die im Alginat kultivierten Chondrozyten zeigten eine deutlich niedrigere Cbfa1-RNA-Expression als diejenigen Zellen in der Monolayerkultur. Insgesamt war die Cbfa1-RNA-Expression von Chondrozyten in der Alginatkultur mit der frisch isolierter Chondrozyten vergleichbar.In der folgenden Untersuchungsreihe wurde ein Teil der im Monolayer gezüchteten, Chondrozyten überführt in die dreidimensionale Alginatkultur. Verglichen mit den Chondrozyten in der Monolayerkultur kam es hierbei zu einem deutlichen Abfall der Cbfa1-RNA-Konzentration bis nahezu auf das Niveau frisch isolierter Chondrozyten. Zusammenfassend lassen sich aufgrund der vorliegenden Ergebnisse folgende Schlüsse ziehen:

Cbfa1-RNA ist sowohl in kultivierten Osteoblasten- und Osteosarkomzellreihen als auch in Chondrozyten nachweisbar. Die Kultivierungsmethode hat bei Chondrozyten Einfluß auf die Cbfa1-RNA Expression. Der Anstieg der Cbfa1-RNA Expression in der Monolayerkultur ist nach Überführung in ein dreidimensionales Alginatsystem zumindest in den ersten Passagen reversibel. Der Abfall der Cbfa1-RNA Expression geht einher mit Redifferenzierungsvorgängen der Zellen in Richtung eines chondrogenen Phänotyps. Die vorliegenden Ergebnisse legen eine Bedeutung des Transkriptionsfaktors Cbfa1 für in vitro bestehende Dedifferenzierungsphänomene kultivierter Chondrozyten nahe. Hierbei scheint die Umgebungsmatrix der Zellen einen direkten Einfluss auf die Cbfa1 Expression zu besitzen. Der Anstieg der Cbfa1-RNA-Expression in der Monolayerkultur kann als Ausdruck einer bestehenden Fähigkeit der Transdifferenzierung der Chondrozyten in Richtung eines osteoblastären Phänotyps gedeutet werden oder aber als eine weitere Ausdifferenzierung in Richtung hypertropher Chondrozyten, wie sie auch im Rahmen der enchondralen Ossifikation zu finden sind. Der Abfall der Cbfa1-RNA-Expression nach Überführung von zuvor in der Monolayerkultur gezüchteten Zellen in die Alginatkultur spricht für eine, zumindest in den ersten Zellpassagen noch gegebene, Fähigkeit der Zellen zur Redifferenzierung. Neuere Untersuchungen legen eine Bedeutung des Transkriptionsfaktors Cbfa1 für pathophysiologische Prozesse im Rahmen von degenerativen oder entzündlichen Gelenkveränderungen in vivo nahe (Wang et al., 2004, Pei et al., 2006). Dies muss jedoch in weiteren Versuchen verifiziert werden.

Chondrocytes are critically dependent on their surrounding extracellular matrix. In healthy joint cartilage they remain phaenotypically stable without any significant differentiation. In contrast, inflammatory, traumatic or degenerative changes of the extracellular matrix lead to changes of the chondrocytic phaenotype including the expression of specific matrix proteins and proliferation. Likewise, change of matrix conditions in-vitro particular in the two-dimensional monolayer-culture is associated with phaenotype switching of chondrocytes. Core binding factor a 1 (Cbfa1) is an essential transcription factor of chondrocytic and osteocytic lineage. The absence or mutation of this gene is associated with anomalies of bone and cartilage development. In this study we confirmed the in-vitro Cbfa1-RNA-expression on osteocytes, osteoblasts, chondrocytes and osteosarcoma cells. In addition, influence of two- and three-dimensional matrix culture on Cbfa1 expression of chondrocytes was investigated. Cbfa1-mRNA expression of freshly isolated chondrocytes was much lower compared with cells cultivated in a monolayer culture. Moreover, Cbfa1 expression on chondrocytes maintained in three-dimensional alginate matrix was lower than in two-dimensional culture, comparable to freshly isolated chondrocytes. Sequential culture with transfer from monolayer to three-dimensional alginate culture led to reduction of Cbfa1-RNA-expression to a similar level of freshly isolated chondrocytes. These results suggest a relevance of Cbfa1 for chondrocyte plasticity in-vitro and in-vivo, i. e. capacity for de-, re-, and transdifferentiation. The extracellular matrix has a profound influence on Cbfa1 expression. The increase of Cbfa1-RNA expression in the monolayer culture could represent a transdifferentiation towards an osteocytic phenotype; alternatively it could be a precondition of subsequent chondrocyte hypertrophy, as seen in enchondral ossification. The decrease of Cbfa1 expression after change of culture conditions from monolayer to the more physiologic three-dimensional matrix during the first cell culture passages does provide additional evidence for chondrocyte plasticity. Recent studies propose a role of Cbfa1 in degenerative and inflammatory joint diseases in-vivo. These findings have to be confirmed in further investigations.