Isolierung, Lokalisation und Charakterisierung Phosphorylcholinmodifizierter Proteine des Trematoden Schistosoma mansoni

Abstract

In der vorliegenden Arbeit wurde ein mit Phosphocholin (PC) modifiziertes Protein des Humanparasiten S. mansoni erstmalig identifiziert. Aus Vorarbeiten ist bekannt, dass PC-Substituenten immunmodulatorische Eigenschaften zugesprochen werden können. Zum einen handelt es sich hierbei um die Aktivierung der B1-Zellen mit entsprechenden Folgeeffekten, zum anderen wird eine Supression der TNF-alpha-Produktion und der Th1-Antwort beschrieben. Zudem konnte gezeigt werden, dass in Anwesenheit PC-substituierter Proteine der proinflammatorische Effekt, vermittelt durch dentritische Zellen ebenfalls supprimiert wurde. Ferner wurde eine verstärkte Aktivierung der antiinflammotorischen T-Helfer (Th2) Immunatwort mit erniedrigtem IFN-gamma, vermehrter IL 10 Produktion und deutlich erhöhtem IgG4 Antikörperlevel beschrieben.Initial galt es Methoden zur Isolierung und Aufreinigung dieses Proteins auszuarbeiten, wobei sich die Etablierung geeigneter Extraktionsbedingungen zur Proteingewinnung aus dem Adultegelhomogenat zu Anfang als besonders schwierig erwies. Die weitaus größte Proteinmenge konnte mittels des Lysispuffers, welcher eigentlich zur Probenvorbereitung im Rahmen der 2D-Gelektrophorese verwendet wird, extrahiert werden. Die weitere Aufreinigung und Charakterisierung des so gewonnenen Proteingemisches erfolgte über eine Proteintrennungen mittels der eindimensionalen (1D) SDS-Gelelektrophorese der 2D-Gelelektrophorese. Die Detektion der PC-positiven Proteinbande im 1D-Gel, bzw. des PC-positiven Spots nach 2D-Gelelektrophorese erfolgte mit dem PC-spezifischen monoklonalen Antikörper (mAK) TEPC-15 in den jeweils im Anschluss an die gelelektrophoretischen Proteintrennungen durchgeführten Westernblots.Es zeigte sich, dass das PC-modifizierte Protein relativ basisch ist und ein apparentes Molekulargewicht von ca. 52 kD aufweist. Weitere Analysen der einzelnen Entwicklungsstadien von S. mansoni zeigten, dass es sich um ein stadienspezifisch exprimiertes Antigen handelt, da die stärksten PC-positiven Banden im Westernblot bei Proteinen von Adultegeln und Eiern nachzuweisen waren. Extrakte von Schistosomula und Cercarien wiesen allenfalls geringe Mengen an PC-modifizierten Proteinen auf. Eine Identifizierung und weitere Charakterisierung des isolierten 52 kDa-Proteins durch proteolytischen Verdau und weiterführende Analysen mittels MALDI-TOF-MS war aufgrund der aktuell unzureichenden Datenlage nicht möglich. Eine Bindung des PC-Substituenten über ein N-Glykan des Proteins scheint aufgrund der nach PNGase-A- und PNGase F-Behandlung erhaltenen Resultate weitgehend ausgeschlossen zu sein. Weiterer Schwerpunkt dieser Arbeit ist zudem die Lokalisation PC-substituierter Strukturen im Bereich des S. mansoni-Adultegels sowie des Eies. Es konnte gezeigt werden, dass im Bereich der Gonaden weiblicher Adultegel, der Eier und in dem das Ei umgebende Granulomgewebe PC-positive Strukturen vorhanden sind. Dies bestärkt zum einen die Hypothese, dass es sich um einen stadienspezifischen Prozess handelt und - im direkten Vergleich mit Analysen zum Vorkommen von Lex- und M2D3H-Epitopen - zum anderen, dass es sich bei diesen Proteinen um PC-modifizierte exkretorische Produkte handelt, welche im Rahmen der Immunevasion eine übergeordnete Rolle spielen könnten. In this thesis, a phophocholine (PC)-modified protein has been identified for the first time in the human trematode parasite S. mansoni. The primary purpose of this study was to work out methods for the isolation and purification of this above-mentioned protein. In this context the establishment of appropriate extraction conditions for protein isolation from adult trematode homogenates proved to be particularly difficult. It turned out that the greatest amount of protein was extractable by means of so-called lysis-buffer which, strictly speaking, was utilised for sample preparation in the scope of 2D-gel electrophoresis. For further purification and characterisation of the obtained protein mixture, protein separation was carried out by means of one-dimensional (1D) SDS-gel electrophoresis and 2D-gel electrophoresis. The detection of PC-positive protein bands in 1D-gels, or rather, of PC-positive protein spots after 2D-gel electrophoresis, as determined by the PC-specific monoclonal antibody (MAb) TEPC-15 in both, was subsequent to gel electrophoresis-protein separation as carried out by Western bloting. This demonstrated that the PC-modified protein is relatively basic with an apparent molecular weight of approximately 52 kDa.Further analysis of the various life-cycle, developmental stages of S. mansoni displayed a stage-specific expression of this antigen in that the strongest Westernblot, PC-positive bands where detectable in adult worm- and egg-proteins. Extracts from schistosomula (the parasitic, juvenile stadium of trematode worm development) and cercariae (free-living, infective stage of humans) demonstrated, at the most, lower amounts of PC-modified proteins. An identification and further characterisation of the isolated 52 kDa protein by proteolytic digestion and subsequent MALDI-TOF-MS analyses were not possible because of the, at present, insufficient data-situation. The possibility of a linkage of the PC-substituents via protein N-glycans would appear, from the obtained PNGase-A/PNGase-F-treatment results, to be largely discounted.A further priority of this project constituted, however, the localisation of PC-substituted structures within the region of the S. mansoni adult worm/egg. Here it could be shown that PC-positive structures existed, especially, in the area of the adult worm gonads, eggs and of the immediate granuloma tissue of the egg itself. This supported, on the one hand, the hypothesis that it refers to a stadium-specific process in direct comparison with analyses on the occurrence of Lex and M2D3H epitopes and, on the other hand, that it concerns PC-modified, secretory proteins which may have a major role in the framework of immunevasion.