Mechanisms of epithelial-to-mesenchymal transition in experimental and idiopathic pulmonary fibrosis

Abstract

Idiopathic pulmonary fibrosis (IPF) is a fatal interstitial lung disease characterized by accumulation of activated myofibroblasts and excessive extracellular matrix deposition, in part mediated through enhanced TGF-beta signaling. TGF-beta1 is a potent inducer of epithelial-to-mesenchymal transition (EMT), the reversible phenotypic switching of epithelial to fibroblast-like cells. Recently, EMT has been demonstrated in alveolar epithelial cells (AECs) and has been proposed as a causative factor in lung fibrosis, but its precise mediators and mechanisms in IPF remains to be resolved. During developmental and disease settings, the phenotypic conversion of the epithelium is under tight transcriptional control, however, the transcription factors eliciting EMT in IPF have yet to be identified. Putative roles for SNAI transcription factors as regulators of EMT during development and a wide variety of diseases including cancer and organ fibrosis have been documented. This study is based on the hypothesis that in AECs, TGF-beta1-induced SNAI transcription factors facilitate the acquisition of new morphology and motility, based on their ability to influence EMT marker gene expression. Thus, the objective of this study was to analyze the molecular mediators of TGF-beta1-induced EMT in vitro, in human A549 and primary mouse AT2 cells, and to assess their contribution to the development of fibrosis in experimental and idiopathic pulmonary fibrosis in vivo. Immunofluorescent costaining of Tjp1 and a-SMA (an epithelial and mesenchymal marker, respectively) demonstrated TGF-beta1-induced EMT in AECs. Furthermore, in vitro, TGF-beta1 treatment increased the expression and nuclear accumulation of the zinc finger transcription factors SNAI1 (Snail) and SNAI2 (Slug), as assessed by RT-PCR and immunofluorescence. Ectopic expression of SNAI1 and SNAI2 proteins was sufficient to induce EMT in A549 cells, even in the absence of TGF-beta1 stimulation. In contrast, the siRNA-mediated depletion of SNAI1 and SNAI2 attenuated TGF-b1-induced AEC migration and EMT in A549 cells. The detection of EMT in vitro, with an increase in SNAI transcription factors was substantiated in vivo in the bleomycin model of pulmonary fibrosis early in disease. In vivo, SNAI expression was elevated in primary AECs isolated from fibrotic lungs, seven days after bleomycin challenge. An indication of occurrence of EMT with an increase in SNAI transcription factors was also corroborated in IPF patient lungs compared to control lungs. Furthermore, the occurrence of EMT, as well as the involvement of transcriptional control of SNAI factors was clarified in a unilateral ureteral obstruction (UUO) mouse model of renal fibrosis. This study shows that (1) TGF-beta1-induced EMT in alveolar epithelial cells is accompanied by elevated expression of SNAI transcription factors, (2) EMT in AECs is essentially controlled by SNAI transcription factors, as ectopic expression of SNAI1 and SNAI2 triggers EMT, whereas depletion of these factors abrogates TGF-beta1-induced EMT, (3) increased expression of these zinc finger transcription factors are detected in an experimental model of lung fibrosis, with indication of the occurrence of EMT, (4) SNAI1 and SNAI2 upregulation have important implications for the development of IPF, (5) the detection of SNAI transcription factors early in EMT in a UUO model of renal fibrosis and the inhibition of EMT by leukocyte blocker treatment further emphasizes the significance of SNAI transcription factors in EMT as a causal factor in disease. Thus, reversal and/or inhibition of EMT may present a valid therapeutic option in lung fibrosis. Die idiopathische pulmonale Fibrose (IPF) ist eine fatale interstitielle Lungenerkrankung, die durch Ansammlung von aktivierten Myofibroblasten und verstärkter extrazellulärer Matrixbildung gekennzeichnet ist. An diesem Vorgang ist der TGF-beta Signalweg beteiligt. Zudem induziert TGF-beta1 die epitheliale-mesenchymale Transition (EMT), die reversible phänotypische Umwandlung von epithelialen zu fibroblasten-ähnlichen Zellen. Kürzlich konnte EMT in Alveolarepithelzellen in der Lungenfibrose gezeigt werden. Während des Entwicklungsprozesses und bei vielen Krankheiten, wie Krebs und Fibrose unterliegt die phänotypische Umwandlung des Epithels strengen Transkriptionsvorgängen. Die einzelnen Transkriptionsfaktoren, die EMT in IPF hervorrufen, sind noch zu identifizieren. Die vermeintliche Rolle von SNAI Transkriptionsfaktoren als EMT Regulatoren in anderen Erkrankungen wurde schon dokumentiert. Die vorliegende Studie basiert auf der Hypothese, dass TGF-beta-induzierte SNAI Transkriptionsfaktoren in alveolaren Epithelzellen EMT-Markerexpression beeinflussen können und somit die Morphologie und Motilität der Zellen verändern können. Das Ziel dieser Arbeit war es, die molekularen Mechanismen von TGF-beta1-induzierter EMT in vitro, in humanen A549 Zellen und primären murinen Alveolarepithelzellen zu untersuchen. Dabei galt es ihre Beteiligung bei der Entwicklung in experimenteller und idiopathischer pulmonaler Fibrose in vivo zu beurteilen. Die TGF-beta1-induzierte EMT in Alveolarepithelzellen wurde anhand epithelialer Proteinen (Tjp1) und mesenchymaler Proteinen (a-SMA) durch Immunfluoreszenz nachgewiesen. Des weiteren wurde in vitro, nach Behandlung mit TGF-beta1, eine erhöhte Expression und nukleäre Ansammlung der Zinkfingerproteine SNAI1 und SNAI2 mittels quantitative RT-PCR und Immunfluoreszenz ermittelt. Die ektopische Expression von SNAI1 und 2 war bereits ausreichend, um EMT in A549 Zellen zu induzieren; auch ohne TGF-beta1 Stimulation. Im Gegensatz dazu, führte eine siRNA vermittelte Verringerung von SNAI1 und 2 zur Abschwächung einer TGF-beta1 induzierten Migration von Alveolarepithelzellen und EMT in A549 Zellen. Der Nachweis von EMT in vitro mit Anstieg an SNAI Transkriptionsfaktoren konnte in vivo im Bleomycinmodell der pulmonalen Fibrose belegt werden. Sieben Tage nach Bleomycin Exposition zeigten primäre Alveolarepithelzellen aus fibrotischen Lungen eine Erhöhung der SNAI Expression. Auch in IPF Lungen bestätigte sich dieses Ergebnis im Vergleich zu gesunden Lungen. Außerdem konnte EMT, sowie die Beteiligung von transkriptionskontrollierten SNAI Faktoren im Mausmodell der renalen Fibrose, einer unilateralen urethralen Obstruktion (UUO), nachgewiesen werden.Zusammenfassend konnte gezeigt werden, dass die TGF-beta1-induzierte EMT in Alveolarepithelzellen mit einer erhöhten Expression von SNAI Transkriptionsfaktoren einher geht. Die Überexpression von SNAI1 und 2 zeigte, dass diese Transkriptionsfaktoren den EMT-Prozeß im wesentlichen triggern, während eine Verringerung dieser Faktoren die TGF-beta1-induzierte EMT aufhebt. Die Erhöhung dieser Zinkfingerproteine, mit dem Hinweis auf EMT, konnte zudem in einem experimentellen Modell der Lungenfibrose nachgewiesen werden. Diese Beobachtung bestätigte sich ebenfalls in humanen IPF-Proben. Der Nachweis von SNAI Transkriptionsfaktoren in EMT im renalen Fibrosemodell, der UUO, und die Hemmung von EMT durch Behandlung mit Leukozytenblockern, heben die Signifikanz dieser Faktoren als Ursache im Krankheitsmechanismus hervor. Eine Aufhebung und/oder Hemmung von EMT könnte somit eine Therapiemöglichkeit in der Behandlung der Lungenfibrose darstellen.