Asymmetric dimethylarginine metabolism and its involvement in the pathogenesis of pulmonary arterial hypertension

Abstract

Protein arginine methylation represents a posttranslational modification undertaken by protein arginine methyltransferases (PRMT) that results in production of protein-incorporated omega-NG-monomethylarginine (L-NMMA), asymmetric omega-NG, NG-dimethylarginine (ADMA), or omega-NG, N G-dimethylarginine (SDMA). Free cellular L-NMMA, ADMA and SDMA can be generated via the proteolytic cleavage of intracellular proteins, thereby also affecting methylarginine content in the plasma. Free methylarginines can be cleared from the body by renal excretion. L-NMMA and ADMA, but not SDMA, can be degraded via enzymes called NG, NG dimmethylarginine dimethylaminohydrolase (DDAH). ADMA is an endogenous inhibitor of nitric oxide synthases (NOS) and a marker of endothelial dysfunction. Increased plasma ADMA levels have been reported in patients with cardiovascular disorders including pulmonary arterial hypertension (PAH), a fatal disease characterized by elevated blood pressure in the pulmonary circulation, due to increased resistance of pulmonary arterioles. The major pathophysiologic hallmark of PAH is pulmonary arterial smooth muscle cell (PASMC) hypertrophy and proliferation, leading to the occlusion of pulmonary arterioles. The interplay between methylarginine synthesis and degradation in vivo, as well as specific alterations to intrapulmonary ADMA levels or distorted generation of ADMA in PAH, however, remains to be elucidated. In the current study, we hypothesized that methylarginine production and degradation is tissue-specific and that the lung has a significant impact on serum/plasma ADMA levels, possibly leading to endothelial dysfunction observed in PAH. To this end, we sought to address the following specific aims: 1) to develop a novel, HPLC-based method to assess protein-incorporated and free cellular methylarginine content in biological samples, 2) to analyze the tissue-specific methylarginine metabolism in normal subjects, and 3) to analyze the methylarginine content in the lungs of patients with PAH compared with healthy donors. First, to analyze tissue-specific methylarginine metabolism in the normal physiological state, we performed high performance liquid chromatography (HPLC)-driven assessment of protein-incorporated and free cellular methylarginine levels, together with Western blot analyses of PRMT and DDAH expression, in organs of the cardiovascular system. Our results revealed that pulmonary expression of type I PRMT was correlated with enhanced protein arginine methylation in the lung. Moreover, our studies also revealed that the kidney and the liver provide complementary routes for clearance and metabolic conversion of circulating ADMA. To address the impact of intrapulmonary ADMA metabolism in pathogenic conditions, we next analyzed lung homogenates of PAH patients. HPLC analysis revealed significantly lower levels of protein-incorporated ADMA in the lungs of PAH patients (n=12), compared with controls (n=10, transplant donors). Western Blot analyses confirmed a significantly decreased content of asymmetrically dimethylated proteins in PAH lungs. The expression of PRMT, in particular PRMT1, was decreased in PAH. Immunohistochemical staining of IPAH and control lungs localized PRMT1 to pulmonary arterial vascular smooth muscle cells (PASMC). Moreover, PRMT1 knockdown in primary PASMC by siRNA technology significantly increased PASMC proliferation. Our results demonstrate that, in the normal physiological state, methylarginine metabolism by the pulmonary system significantly contributes to circulating methylarginine levels. In pathogenic conditions, protein-incorporated ADMA concentrations do not reflect free cellular levels of ADMA in the lung. This may be explained by the alterations of DDAH activity in the lung, which, consequently, regulate ADMA content in the serum of IPAH patients. In addition, our studies demonstrated a novel regulatory role of PRMT1 in progression of PAH, by the alteration of PASMC proliferation, a major characteristic of PAH. This led to conclusions that protein arginine methylation plays a pivotal role in the pathogenesis of PAH. Posttranslationale Protein-Arginin Methylierung erfolgt durch eine Gruppe spezifischer Protein-Arginin Methyltransferasen (PRMTs), die neben der Bildung von asymmetrischem Dimethylarginin (ADMA) auch für die Synthese von Monomethylarginin (L-NMMA) und symmetrischem Dimethylarginin (SDMA) verantwortlich sind. Die Freisetzung von Methylarginine in das Blutplasma erfolgt nach heutigem Wissensstand über die Proteolyse zellulärer, methylierter Proteine. Alle Methylargininformen werden über renale Exkretion aus dem Körper eliminiert. Neuere Studien heben die Metabolisierung von ADMA und L-NMMA durch das Enzym Dimethylarginin-Dimethylaminohydrolase (DDAH) als Hauptabbauweg hervor. ADMA ist ein endogener Inhibitor der NO-Synthase und ein Marker für endotheliale Fehlfunktion. Eine erhöhte ADMA Konzentration im Blut wird bei verschiedenen kardiovaskulären Erkrankungen, so auch bei pulmonal-arterieller Hypertonie (PAH), für einen Mangel an biologisch verfügbarem NO verantwortlich gemacht. Die pulmonal-arterielle Hypertonie ist durch eine pathologische Hypertrophie und Proliferation pulmonalarterieller glatter Muskelzellen (PASMC) gekennzeichnet, die eine Okklusion pulmonaler Arteriolen zur Folge hat. Ob ein Zusammenhang zwischen Arginin- und Dimethylargininstoffwechsel und den bei PAH zu beobachtenden Symptomen vorliegt, wurde bislang nicht untersucht. Deshalb sollte in der vorliegenden Studie geprüft werden, ob der Methylarginin-metabolismus der Lunge signifikant zur ADMA Konzentration im Blut beiträgt und somit an der Ausbildung endothelialer Fehlfunktionen beteiligt sein könnte. Im Konkreten sollten hierfür folgende Vorhaben realisiert werden: (1) Entwicklung einer auf Hochdruckflüssigkeitschromatographie-basierenden Methode zur Quantifizierung von protein-inkorporiertem und freiem Methylarginin in biologischen Proben, (2) Analyse des gewebespezifischen Methylargininmetabolismus und (3) Bestimmung des pulmonalen Methylarginingehaltes von PAH Patienten und gesunden Organspendern. Zur Beschreibung des Methylargininmetabolismus unter normalen physiologischen Bedingungen wurden protein-inkorporiertes und freies Methylarginin in Organen des kardiovaskulären Systems bestimmt. Zudem wurde vergleichend Proteinexpression und Aktivität der PRMTs und DDAHs ermittelt. Unsere Untersuchungen ergaben eine klare Korrelation zwischen pulmonaler Typ I PRMT Proteinexpression und erhöhter Protein-Arginin Methylierung. Zudem konnte gezeigt werden, dass Niere und Leber komplementär an der Eliminierung und Metabolisierung von ADMA und L-NMMA beteiligt sind. Zur Beurteilung der Frage, ob bei PAH ein geänderter Dimethylargininstoffwechsel zu beobachten ist, wurde Lungenhomogenat mittels HPLC untersucht. Die Analyse bei PAH Patienten (n=12) und gesunden Organspendern (n=10) ergab eine signifikante Abnahme an protein-inkorporiertem ADMA bei PAH Patienten. Zudem konnte über Western-Blot Analyse ein reduzierter Gehalt an asymmetrisch dimethylierten Proteinen nachgewiesen werden. Bei PAH Patienten zeigte sich auch eine signifikant reduzierte Expression jener Protein-Arginin-Methyltransferasen, insbesondere PRMT 1, die für eine asymmetrische Dimethylierung von Zielproteinen verantwortlich sind. Immunohistochemische Untersuchungen führten zu dem Ergebnis, dass PRMT 1 überwiegend in PASMCs lokalisiert ist. Zudem resultierte die Reduktion der PRMT 1 Expression mittels siRNA Technologie in einer Zunahme der PASMC Proliferation. Aus den vorliegenden Ergebnissen lässt sich somit schlussfolgern, dass der pulmonale Dimethylargininmetabolismus maßgeblich zum Plasma ADMA-Spiegel beiträgt. Bei PAH Patienten konnte keine Korrelation zwischen protein-inkorporiertem ADMA und freiem Methylarginin nachgewiesen werden. Dieses Ergebnis deutet auf eine Änderung der pulmonalen DDAH Aktivität und Plasma ADMA-Werte bei PAH Patienten hin. Des Weiteren konnte eindeutig demonstriert werden, dass PRMT 1 an der Regulation der PASMC Proliferation beteiligt ist. Zusammenfassend lässt sich somit feststellen, dass Protein-Arginin Methylierung an der Entwicklung und am Fortschreiten von PAH beteiligt sein könnte.