Role of cGMP phosphodiesterases in idiopathic pulmonary fibrosis

Abstract

Idiopathic Pulmonary Fibrosis (IPF) is a progressive interstitial lung disease of unknown etiology associated with high morbidity and mortality, and further characterized by abnormal alveolar epithelial and fibro-proliferative responses, excessive extra-cellular matrix deposition, patchy inflammatory infiltrations and progressive loss of normal lung structure. At present there is no demonstrably effective therapy for blocking or reversing the progression of the disease. This situation demands a better understanding of the molecular and cellular mechanisms involved in the pathogenesis of IPF. Current evidence suggests a role of cyclic guanosine monophosphate phosphodiesterases (cGMP-PDEs) in the pathogenesis of various proliferative lung diseases, including IPF. Lung PDE6 expression and function has received little or no attention. The present study aimed to characterize (i) cGMP PDEs profile in IPF, (ii) PDE6 subunits expression in human lung, (iii) PDE6 subunits expression and alteration in IPF and (iv) functionality of the specific PDE6D subunit. The experiments were carried out with human lung samples from donors and IPF patients. RT-PCR analyses from donor and IPF human lungs revealed up-regulation of PDE1A, PDE10A and PDE11A in the IPF lungs and expression of PDE6 subunits mRNA transcripts in human lungs. Westernblot analysis showed 2-fold up-regulation of PDE6A and PDE6B, and 2-fold down-regulation of PDE6D and membrane localization of PDE6G in the IPF lungs as compared to the donor lungs. Immunohistochemical analysis showed alveolar epithelial localization of the PDE6 subunits. RT-PCR analysis from donor and IPF-derived human primary alveolar type (AT) II cells confirmed the cellular localization of the PDE6 subunits and the down-regulation pattern of PDE6D. Further, siRNA-mediated PDE6D knockdown and an ectopic PDE6D expression in A549 cells demonstrated the modulatory effects of PDE6D on alveolar epithelial cell (AEC) proliferation. Additionally, we showed that these effects specifically involve ERK phosphorylation. Collectively, we report (i) mRNA expression profile of cGMP PDEs in IPF, (ii) previously unrecognized PDE6 expression in human lungs, (iii) pronounced alterations of PDE6 subunits in IPF-derived lungs and (iv) characterize the functional role of PDE6D in AEC proliferation. Die idiopathische pulmonale Fibrose (IPF) ist eine progressive interstitielle Lungenerkrankung unbekannter Ätiologie, assoziiert mit hoher Morbidität und Mortalität. IPF charakterisiert sich weiterhin durch abnormale epitheliale und fibro-proliferative Reaktionen, exzessive Ablagerung extrazellulärer Matrix, ungleichmäßige inflammatorische Infiltrate und einen progressiven Verlust der normalen Lungenstruktur. Gegenwärtig existiert keine nachweislich effektive Therapie zur Beeinflussung des Krankheitsverlaufs. Diese Tatsache unterstreicht die Notwendigkeit für ein besseres Verständnis der molekularen und zellulären Mechanismen, die in der Pathogenese der IPF involviert sind. Neue Studien weisen auf eine Rolle der Phosphodiesterasen des zyklischen Guanosinmonophosphats (cGMP-PDEs) an der Pathogenese von unterschiedlichen Lungenerkrankungen, einschließlich IPF. Allerdings wurden die Expression und Funktion der Lungen-Phosphodiesterase 6 (PDE6) bisher wenig untersucht. Die vorliegende Studie hat sich Folgendes zum Ziel gesetzt: (i) die Charakterisierung der Expressionsprofile der cGMP-PDEs bei IPF in der Lunge, (iii) die Charakterisierung der Expression der PDE6-Untereinheiten in der Lunge, (iii) die Untersuchung der Expressen der PDE6-Untereinheiten bei IPF und (iv) charakterisierung der Funktion der PDE6D-Untereinheit. Untersucht wurde Lungenmaterial von gesunden Probanden und IPF-Patienten. Durch RT-PCR wurde eine Hochregulation der Gen-Transkription von PDE1A, PDE10A und PDE11A in IPF-Proben sowie eine Basis-Transkription der PDE6-Untereinheiten nachgewiesen. Western-Blot-Experimente zeigten eine Hochregulation von PDE6A und PDE6B ums Zweifache und eine gleichstarke Abschwächung von PDE6D bei IPF im Vergleich zu gesunden Probanden. Darüber hinaus wurde eine Membranlokalisation der PDE6G bei IPF festgestellt. Die immunhistochemischen Untersuchungen zeigten die Lokalisation der PDE6-Untereiheiten im alveolaren Epithel. RT-PCR-Analysen von primären Typ II alveolaren Zellen (ATII) von Probanden und IPF-Patienten bestätigten die Anwesenheit der PDE6-Untereinheiten und die Herunterregulation von PDE6D bei IPF. Durch siRNA-Knockdown von PDE6D und ektopische Expression von PDE6D in der A549 Zellinie wurden die modulierenden Effekte dieser Untereinheit auf die Proliferation von alveolaren Epithelzellen (AEC) demonstriert. Es konnte auch gezeigt werden, daß diese Effekte spezifisch die Phosphorylierung von ERK beeinflussen. Zusammenfassend, wurden in dieser Arbeit (i) die Expressionsprofile der Phosphodiesterasen des zyklischen Guanosinmonophosphats (cGMP-PDEs) in IPF-Lungengewebe erstellt. (ii) eine bis dato nicht beschriebene Expression von PDE6 in der humanen Lunge konnte nachgewiesen werden. (iii) die Veränderung der PDE6-Espression in IPF-Lungenproben und (iv) die Rolle der PDE6D-Untereinheit bei der Proliferation von AEC wurden analysiert.