Pharmacological manipulation of dendritic cells in vitro and in vivo

Abstract

Dendritische Zellen gehören zum angeborenen Immunsystem und präsentieren professionelle Antigen-präsentierende Zellen, die immunologische Antworten initiieren und anregen. In den bestimmten Fällen wie einer Transplantation ist es erwünscht, dass die körpereigene Abwehr selektiv reduziert wird, so dass der Körper das körperfremde Organ nicht abstößt, jedoch gleichzeitig eine ausreichende Immunität gegen Bakterien, Viren und Krebs erhalten bleibt.Ein therapeutischer Ansatz wäre die selektive Hemmung dendritischer Zellen. Sie spielen eine zentrale Rolle im Immmunsystem und präsentieren interessante Ziele für die pharmakologische Manipulation. Eine Hemmung dendritischer Zellen führt zu einer verringerten endozytotischen Antigenaufnahme, -präsentation und Produktion proinflammatorischer Zytokine und könnte folglich die chronsiche Organabstoßung verzögern oder verhindern. In dieser Arbeit wurde untersucht, ob man Sanglifehrin A (SFA), eine neue immunophilin bindende Substanz, zur pharmakologischen Programmierung tolerogener Dendritischer Zellen nutzen kann, um einen Effekt in Alloimmunitätsmodellen und Organtransplantationsmodellen zu zeigen. Die pharmakologischen Effekte von SFA auf dendritische Zellen wurden in vitro und in vivo untersucht. In ersten Versuchen zeigten wir, dass SFA keinen Effekt auf Differenzierung oder phänotypische Reifung von Dendriten hat. Als nächstes untersuchten wir eine Reihe von Zytokinen, unter anderem IL-12p70, das eine wichtige Rolle bei der Pathogenese von Entzündungen und Autoimmunerkrankungen spielt. Wir fanden heraus, das SFA die Produktion von bioaktivem IL-12p70 in dendritschen Zellen reduziert, die Hauptquelle für bioaktives IL-12. Im direkten Vergleich zu dem verwandten Calcineurin-Inhibitor Cyclosporin A und dem mammalian Target of Rapamycin (mToR) Hemmer Rapamycin, hemmt nur SFA schon innerhalb einer Stunde 80 95 % der IL-12p70 Produktion von differenzierten Dendriten. Um zu zeigen, das es sich um einen stimulusunabhängigen Mechanismus handelt, wurden die Versuche sowohl mit Toll-like Rezepor 3 als auch 4 Liganden durchgeführt. Es wurden Rezeptorverdrängungsexperimente durchgeführt, bei denen molare Überschüsse von Cyclosporin A vor der Zugabe von SFA zur Zellkultur gegeben wurden. Die Ergebnisse zeigen eine äqipotente Hemmung der IL-12p70 Produktion mit oder ohne Cyclopsorin A: Daraus lässt sich eine Cyclophilin- unabhängige Blockade der IL-12p70 Produktion durch SFA vermuten.Die starke Hemmung der IL-12p70 Produktion wurde in einer Versuchsreihe mit gereinigten peripheren Blut-Dendriten bestätigt. Echtzeit-PCRs ergaben eine 84-95% Hemmung der IL-12p40-, IL-12p35- und der IL-23-spezifischen p19 Transkription.In einem nächsten Schritt sollte untersucht werden, ob diese in vitro Ergebnisse im in vivo Mausmodell reproduzierbar sind, um die klinische Relevanz dieser Ergebnisse zu klären. Die in vivo Untersuchungen zeigten, das dreitägige Injektionen von SFA in Mäuse (Kontrolltiere erhielten eine wirkstofffreie Trägerlösungen injiziert) und die darauffolgende in vivo Stimulation mit LPS/IL-4 70% der Produktion von bioaktivem IL-12 hemmten. Mit weiteren unabhängigen Modellen zeigten wir, das SFA mehr als 90% der IL-12p70 Produktion hemmt, während es keinen Effekt auf IL-10 und TNF-a hat. Die in vivo Behandlung mit SFA zeigte keine Einfluß auf die in vivo Expansion oder die phänotypische Reifung von DC Subtypen und hatte keinen Effekt auf die DC Population.Außerdem hemmte SFA die rezeptorvermittelte Endozytose und Makropinozytose und die indirekte Antigenpräsentation von CD11c+ dendritschen Zellen in vivo. Unsere Ergebnisse zeigten zum ersten Mal den Effekt von Sanglifehrin A in vivo. Die Ergebnisse lassen vermuten, insbesondere die Bestätigung durch die in vivo Experimente, das es sich bei Sanglifehrin A um eine Subanz mit einem einzigartigen Wirkprofil gegenüber dendritschen Zellen handelt: starke Hemmung sowohl der Antigen-Aufnahme als als auch der IL-12p70 Produktion, aber keinen signifikanten Einfluß auf Differenzierung, Expansion oder Expression von Oberflächenmarkern dendritischer Zellen. Unserem Wissen nach gab es bisher keine immunosuppressive Substanz, die zwei Schlüsselfunktionen, IL-12 Produktion und Antigenaufnahme hemmt, aber keine Effekte auf Differenzierung oder Expansion hat.Wir vermuten, das SFA eine neue Klasse immunophilinbindender Immunsuppressiva darstellt, die eine hohe Aktivität auf dendritische Zellen zeigt und in der Kombination mit anderen Immunsuppressiva synergistische Wirkungen entfaltet. Somit könnte die Kombination von immunsuppressiven Substanzen mit Sanglifehrin A ein wirkungsvoller Ansatz sein, um chronische Tranplantatabstoßung zu verhindern. Dendritic Cells (DC) belong to the innate immunity and present professional Antigen (AG) presenting cells that initiate and regulate immune responses. Acute organ rejection is very well controllable with the available immunosuppressive drugs, but new drugs still have to be developed for chronic allograft rejection.A selective inhibition of dendritic cells desirably leads to less endocytotic capacity, Ag uptake and presentation and production of proinflammatory cytokines and is assumed delaying allograph rejection. With respect to the central role of DC in immunity, they are interesting therapeutic targets for pharmacological manipulation of immune responses. The impact of Sangliferin A (SFA) as a novel means for pharmacological programming of tolerogenic DC in models of alloimmunity and solid organ transplantation is to be evaluated. Therefore the pharmacological effects of the novel immunophilin-binding agent SFA on DC were investigated in vitro and in vivo.This work shows that SFA does not affect DC differentiation and phenotypical maturation. IL-12p70 plays a critical role in the pathogenesis of inflammation and autoimmune diseases. We discovered that SFA abrogates bioactive IL-12p70 production by human DC, the major producers of this cytokine. In direct comparison to the related calcineurin inhibitor Cyclosporin A and the mammalian target of Rapamycin inhibitor Rapamycin, SFA acts uniquely within 1h to inhibit (80-95%) IL-12p70 production by differentiated DC. To show that the inhibition is stimulus independent further experiments with Toll-like receptor 3 and 4 ligands were performed. Competitive experiments with a molar excess of Cyclosporin A indicate a cyclophilin A independent blockade of IL-12p70 production. We confirm potent inhibition of IL12p70 production by SFA using purified human blood DC.Real-time RT-PCR reveals 84-94% suppression of IL-12p40, IL-12p35 and IL-23-specific p19 transcription.Another major aim of this work was to reproduce the in vitro findings in an in vivo mouse model in order to clarify the clinical relevance of these findings. Within these in vivo investigations it could be shown, that three day in vivo injections of SFA into mice and stimulation of the animals with LPS/IL-4 blocked 70% of bioactive IL-12 production compared to vehicle injected control animals. By using independent models, we provide evidence that SFA abrogates that SFA abrogates >90% IL-12p70 production in vivo while having no effect on IL-10 AND TNF-a. SFA treatment in vivo showed no influence on in vivo expansion or phenotypic maturation of DC subsets and had nor effects on DC subpopulations.Furthermore, SFA profoundly decreases DC receptor-mediated endocytosis and macropinocytosis and inhibits indirect antigen presentation of CD11c+ DC in vivo. Our results are the first to reveal the immunosuppressive activity of SFA in vivo. Taken together, our in vivo experiments suggest that SFA displays a unique mode of action with respect to DC: strong inhibition of both antigen uptake and bioactive IL-12 production but no significant effects on DC differentiation, expansion and surface costimulatory expression. To our knowledge, no immunosuppressive agent has been reported to date that allows potent suppression on the two key DC functions antigen uptake and IL-12 production without interfering with DC differentiation or DC expansion.We propose that SFA represents a novel class of immunophilin-binding immunosuppressants with high activity against DC and in addition has synergetic effects if combined with other immunopilins like CsA. For an effective prevention of chronic allograft rejection the combination of immunosuppressive drugs with SFA might be a powerful approach.