Macrophage-epithelial crosstalk during alveolar epithelial repair following pathogen-induced pulmonary inflammation

Abstract

Bacterial invasion of the alveolar air space is followed by the fast, tightly regulated immune response facilitating a successful pathogen clearance. Upon pathogen recognition activated resident alveolar macrophages (AMf;) early release pro-inflammatory cytokines, stimulating neighbouring alveolar cells to produce chemokines which in turn mediate the infiltration of neutrophils, exudate macrophages and lymphocytes. The following inflammatory reaction and the pathogen itself leave a damaged alveolar barrier associated with pulmonary oedema and impaired gas exchange. Consequently, epithelial repair processes are initiated to restore the normal lung homeostasis. During the later phase of infection AMf; have been shown to acquire an anti-inflammatory phenotype thereby enhancing alveolar repair processes. However, the potential of early activated, pro-inflammatory AMf to influence epithelial repair remains largely elusive. Therefore, in the present thesis it was investigated whether activated AMf contribute to alveolar epithelial repair upon LPS challenge in vitro and in vivo, as well as in K. pneumoniae pneumonia, and the molecular interaction pathways involved were analysed. The cross-talk between resident alveolar macrophages and alveolar epithelial cells during alveolar repair was assessed in an in vitro co-culture system and an in vivo model of LPS-induced acute lung injury. Gene expression and protein analysis showed that LPS-activated alveolar macrophages stimulated alveolar epithelial cells (AEC) to express growth factors, particularly GM-CSF upon co-culture. Antibody neutralization experiments revealed epithelial GM-CSF expression to be macrophage TNF-alpha dependent. GM-CSF elicited proliferative signalling in alveolar epithelial cells via autocrine activation of the transcription factor STAT 5 and Cyclin D1 expression. Notably, macrophage TNF-alphab induced epithelial proliferation in wild-type but not in GM-CSF-deficient alveolar epithelial cells as shown by [3H]-thymidine incorporation and cell counting. Matrigel:collagen AEC culture preserving the type II phenotype in vitro supported the concept that the proliferative response to GM-CSF is related to the type II AEC phenotype. Moreover, intra-alveolar TNF-alpha neutralization impaired alveolar epithelial type II cell proliferation in LPS-injured mice in vivo, as investigated by flow cytometric Ki67 and immunofluorescence staining of lung sections. Additionally, GM-CSF-deficient mice displayed reduced AEC II proliferation and sustained alveolar barrier dysfunction upon LPS treatment compared to wild-type and SPC-GM mice (overexpressing GM-CSF in AEC II in a GM-CSF-deficient background). Similarly, K. pneumoniae lung infection confirmed the findings in the LPS-model and resulted in early release of macrophage TNF-alpha and epithelial GM-CSF, as well as subsequent TNF-alpha-dependent AEC II proliferation during alveolar repair events.Collectively, these findings indicate that TNF-alpha released from activated resident alveolar macrophages induces epithelial GM-CSF expression, which in turn initiates alveolar epithelial type II cell proliferation and thus contributes to restore alveolar barrier function. Die bakterielle Infektion des Alveolarraumes ist regelhaft von einer schnellen, streng koordinierten Immunantwort gefolgt, deren Ziel die rasche Elimination des Erregers ist. Nach der Erkennung des Erregers über spezielle Pathogen-Rezeptoren setzen Alveolarmakrophagen (AMf;) pro-inflammatorische Zytokine frei und stimulieren benachbarte Parenchymzellen zur Produktion von Chemokinen, welche letztendlich die Chemotaxis neutrophiler Granulozyten, von Exudatmakrophagen und Lymphozyten vermitteln. Diese Immunreaktion, aber auch die Infektion selbst, führen zu einer Destruktion der alveolären Barriere mit konsekutivem alveolärem Ödem und eingeschränktem Gasaustausch. In der Folge werden alveoläre Reparaturprozesse in Gang gesetzt, um die Organfunktion wieder herzustellen. Alveolarmakrophagen aquirieren in der Spätphase der Entzündung einen anti-inflammatorischen Phänotyp und können solche Reparaturprozesse in Gang setzen. Jedoch war das Reparaturpotenzial früh aktivierter, pro-inflammatorischer Alveolarmakrophagen bis dato ungeklärt. In der vorliegenden Arbeit wurde deshalb untersucht, ob früh-inflammatorisch aktivierte residente Alveolarmakrophagen zur alveolarepithelialen Reparatur nach LPS-Applikation in vitro und in vivo und im Klebsiella-Pneumonie-Modell beitragen und welche die zugrunde liegenden molekularen Mechanismen sind. Es wurden die Mediatoren des Cross-talk zwischen Alveolarmakrophagen und Alveolarepithel in der alveolarepithelialen Reparatur in einem in vitro Ko-Kulturmodell und im Mausmodell der LPS-induzierten Acute Lung Injury ermittelt. Genexpressions- und Proteinanalysen zeigten hierbei, dass LPS-aktivierte Alveolarmakrophagen in der Ko-Kultur Alveolarepithelzellen zur Freisetzung epithelialer Wachstumsfaktoren, insbesondere von GM-CSF, stimulieren. Neutralisationsexperimente zeigten, dass die epitheliale GM-CSF Expression abhängig war von Makrophagen-sezerniertem TNF-alpha. GM-CSF induzierte autokrin eine STAT5-Cyclin D1-vermittelte proliferative Signalkaskade in Alveolarepithelzellen. Interessanterweise konnte mittels [3H]-Thymidin-Einbau und Zellzählung gezeigt werden, dass TNF-alpha eine epitheliale Proliferation in Wildtyp-, nicht jedoch in GM-CSF-defizienten Alveolarepithelzellen induziert. Ähnliche Experimente mit Alveolarepithelzellen, die auf einer Matrigel:Collagen-Matrix kultiviert wurden und dabei einen Phänotyp II (AEC II) behielten, zeigten, dass diese GM-CSF-vermittelte Proliferationsantwort an den Phänotyp II gekoppelt war. Darüberhinaus konnte im LPS-Mausmodell gezeigt werden, dass die intraalveoläre Neutralisation von TNF-alpha die Proliferation von Typ II Alveolarepithelzellen in vivo, gemessen anhand der Ki-67 Expression im FACS und in der Immunfluoreszenz, deutlich reduzierte. Zusätzlich zeigten GM-CSF-defiziente Mäuse eine eingeschränkte Alveolarepithelzellproliferation und eine deutlich prolongierte Dysfunktion der alveolären Barriere nach intratrachealer LPS-Gabe verglichen mit Wildtyp- oder SPC-GM-Mäusen (mit Überexpression von GM-CSF im Alveolarepithel, generiert in GM-CSF-defizienten Mäusen). Im Klebsiella-Pneumoniemodell konnten diese Mechanismen bestätigt werden. Zusammenfassend konnte gezeigt werden, dass TNF-alpha, welches von LPS-aktivierten residenten Alveolarmakrophagen freigesetzt wird, eine alveolarepitheliale GM-CSF-Expression induziert. GM-CSF wiederum initiiert über eine autokrine Signalkaskade die Proliferation von Typ II Alveolarepithelzellen und trägt somit wesentlich zur Erneuerung und Funktionalität der alveolarepithelialen Barriere bei.