Quantitative histochemische und immunhistochemische Darstellung der Succinatdehydrogenaseaktivität und der Proteinuntereinheiten in Herz und Lunge der Ratte

Abstract

Sauerstoff ist ein essenzielles Substrat für alle Säugetierzellen. Die Mechanismen der zellulären Sauerstoffmessung sind bislang noch nicht vollständig geklärt. In der hypoxie-abhängigen Regulation der Gentranskription spielen Prolylhydroxylasen eine entscheidende Rolle, bei der Einleitung der hypoxischen pulmonalen Vasokonstriktion sind hingegen andere Mechanismen aktiv. Als einer der hierbei beteiligten Kandidaten gilt Komplex II der mitochondrialen Atmungskette (Synonym: Succinatdehydrogenase = SDH). Frühere Arbeiten zeigten, dass SDH-Aktivität nicht ubiquitär in Mitochondrien nachweisbar ist. Sie fehlt beispielsweise in axonalen Endigungen und in einzelnen Zelltypen der Lunge. Ein erster Schritt in der Klärung der Fragestellung der Beteiligung der SDH an Sauerstoffsensormechanismen ist daher die Untersuchung von Zellen verschiedener Systeme auf das Vorhandensein von Komplex II. Ziel dieser Arbeit war es, Gewebe von Herz und Lunge der Ratte auf das Vorhandensein von SDH sowie die Untereinheitenverteilung des Enzyms innerhalb der einzelnen Gewebe zu untersuchen. Des Weiteren sollte geklärt werden, ob die SDH-enthaltenden Zellen eine zur Proteinmenge korrelierende, histochemisch nachweisbare Enzymaktivität zeigen und ob die Mitochondrienmenge einer Zelle mit dem SDH-Gehalt korreliert.Der Proteingehalt an SDH-Untereinheiten wurde mittels quantitativer Immunfluoreszenz und die SDH-Enzymaktivität mittels quantitativer Histochemie bestimmt. Für die immunhistochemische Darstellung wurden Antikörper gegen die einzelnen SDH-Untereinheiten A, B, C und D durch Immunisierung von Kaninchen und Meerschweinchen hergestellt. Diesem folgte die Entwicklung eines optimierten Inkubationsprotokolls, das für die gesamte Untersuchung genutzt wurde. Des Weiteren wurde zum Vergleich ein kommerziell erhältlicher monoklonaler Antikörper gegen die Untereinheit B eingesetzt. Zur Bestimmung der Mitochondrienmenge wurde der Komplex V immunhistochemisch bestimmt. Die glatte Muskulatur wurde mit einem Antikörper gegen alpha-Smooth muscle actin identifiziert. Durch die Immunisierung mit für die einzelnen Untereinheiten spezifischen Peptidsequenzen und Affinitätsreinigung konnten immunhistochemisch nutzbare Antikörper für die SDH-Untereinheiten A, B und C generiert werden. Für die erfolgreiche immunhistochemische Darstellung war eine Mikrowellenbehandlung der Schnitte erforderlich. Der SDHD-Antikörper konnte hingegen auf Grund mangelnder Spezifität nicht zur weiteren Auswertung genutzt werden. Es zeigte sich, dass alle Zellen der untersuchten Gewebe SDH enthielten. Insbesondere gilt dies auch entgegen früherer Arbeiten für die kleinen Lungenarterien und die Alveolarsepten. Grundsätzlich waren die immunhistochemisch detektierbaren SDH-Untereinheiten innerhalb eines Gewebes quantitativ gleichermaßen vertreten. Auch die immunhistochemisch bestimmte Enzymmenge und die histochemisch bestimmte Enzymaktivität korrelierten bis auf die Ausnahmen beim Bronchialepithel, den Alveolarsepten und der glatten Muskulatur der kleinen Bronchi (< 100 µm).Beim Vergleich der SDH-Markierungsintensität mit der des Komplex V zeigten sich gewebespezifische Unterschiede, die für zelltypspezifische Unterschiede in der Zusammensetzung der Atmungskettenkomplexe sprechen. Besonders deutlich zeigte sich dies im plurivakuolären Fettgewebe, in dem die oxidative Phosphorylierung entkoppelt ist und dementsprechend eine proportional minimale Komplex V-Menge immunhistochemisch nachgewiesen werden konnte.In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass alle untersuchten Zelltypen in Herz und Lunge SDH enthalten, wenn auch in gewebespezifischem Verhältnis zu Komplex V. Weiterhin sprechen die vorliegenden Ergebnisse für eine koregulierte Expression von SDH-Untereinheiten innerhalb einer Zelle. Dies gilt insbesondere auch für die kleinen Lungenarterien, in denen in früheren histochemischen Arbeiten keine SDH-Aktivität nachgewiesen wurde, aufgrund funktioneller Daten jedoch eine Beteiligung der SDH am Sauerstoffsensormechanismus angenommen wurde. Oxygen is an essential substrate for all mammalian cells. The mechanisms of cellular oxygen sensing are still not fully understood. Prolylhydroxylases are key regulators of hypoxia-regulated gene transcription, while other, less characterized mechanisms operate in hypoxic pulmonary vasoconstriction. Here, complex II of the mitochondrial respiratory chain (synonym: succinate dehydrogenase = SDH) is among the candidates initiating this hypoxic response. Previous work demonstrated that SDH activity is not ubiquitously found in mitochondria but lacks in axonal nerve endings and in some pulmonary cell types. On this background, rat cardiopulmonary cell types were investigated for the presence of complex II in order to obtain basic information about its possible involvement in oxygen sensor mechanisms in these cells. Antisera directed against SDH subunits A, B, C and D were generated in rabbits and guinea-pigs and tested for their suitability for use in quantitative immunohistochemistry. In addition, a commercially available monoclonal SDH-B antibody was used for comparison, an anti-alpha-smooth muscle actin antibody served to identify smooth muscle cells, and a complex V-antibody served to label the total mitochondria content of the cells. SDH protein content, as determined by quantitative immunofluorescence, was compared to SDH activity, as determined by quantitative enzyme histochemistry.Immunization with synthetic peptides and affinity purification yielded specific antisera for SDH subunits A, B and C, but not for SDH-D. Microwave treatment of tissue sections was required for successful immunohistochemical labelling. All investigated cell types of heart and lung contained immunoreactivity to these subunits and SDH enzyme activity. In particular, this also applied for smallest intra-acinar pulmonary arteries which previously have been described to lack SDH activity. In principle, the immunohistochemically detectable SDH subunits were contained in the same relative proportion within the different tissues. There was also a clear correlation between immunohistochemically quantified SDH subunits and histochemically assessed SDH activity, except for bronchial epithelium, the cells of the alveolar septum and smooth muscle of smallest bronchi (< 100 µm). Comparison of SDH- and complex V-labelling revealed cell-type specific relative proportions suggesting cell-type specific compositions of the mitochondrial respiratory chain. This was particularly evident in mediastinal plurivacuolar fat tissue in which oxidative phosphorylation is uncoupled and where, accordingly, complex V was detectable by immunofluorescence in only minimal amounts.Collectively, the present data demonstrate the presence of SDH in all investigated cell types of rat heart and lung with a cell-type specific relative proportion compared to complex V. Moreover, the data are suggestive for co-regulated expression of SDH subunits within all cells. In particular, this also applies for smallest intra-acinar pulmonary arteries in which previous histochemical studies failed to detect SDH activity although functional data have suggested a participation of SDH in the oxygen sensor mechanism of these vessels.