Untersuchungen zur genetischen Regulation des Tryptophan-abhängigen Pigmentstoffwechsels von Malassezia furfur und Aufklärung der genetischen Sequenz des Schlüsselenzyms Mf_Tam1, einer Tryptophan-Aminotransferase

Abstract

Die Pityriasis versicolor (PV) gilt als eine der häufigsten erregerbedingten Dermatosen weltweit. Sie geht mit einem weiten Spektrum verschiedener Charakteristika einher, wie dem Auftreten von hyperpigmentierten aber auch depigmentierten Läsionen, einer relativen Unempfindlichkeit der Depigmentierungen gegenüber UV-Licht, Fluoreszenz der Läsionen im Woodlicht (311nm) und einem in Relation zur Pilzlast nur gering ausgeprägtem entzündlichem Infiltrat. Bislang ist die Pathogenese der Erkrankung nicht geklärt.Als Auslöser der Erkrankung gelten Hefen der Gattung Malassezia, in den gemäßigten Breiten vor allem M. globosa, während in tropischen Regionen auch M. furfur eine stärkere Rolle spielt. Mayser und Mitarbeiter entdeckten einen Tryptophan-abhängigen Pigmentstoffwechsel in M. furfur, dessen Metabolite Eigenschaften aufweisen, die den Symptomen der PV entsprechen. Diese Pigmente konnten bislang jedoch nicht aus Läsionen der PV isoliert werden. Auch konnte die Pigmentbildung bislang nicht in M. globosa induziert werden.In der vorliegenden Arbeit wurden molekularbiologische Werkzeuge etabliert, um die genetische Regulation des Tryptophan-abhängigen Pigmentstoffwechsels von M. furfur zu untersuchen. Mit einer wahrscheinlichen Iron-Sulfur-Einheit einer Succinatdehydrogenase wurde ein Housekeeping-Gen (mf_sdh2) in M. furfur identifiziert, das in Expressionsanalysen mit der Tryptophan-abhängigen Pigmentsynthese assoziierter Gene genutzt werden konnte. Darüber hinaus bildet die Kenntnis seiner genomischen Sequenz die Grundlage für die Entwicklung einer ersten spezifischen Resistenzkassette auf dem Weg zur Erarbeitung eines Systems zur homologen Genrekombination für M. furfur.Darüberhinaus konnten in der vorliegenden Arbeit die genomische Sequenz und der Open Reading Frame des wahrscheinlichen Schlüsselenzyms der Tryptophan-abhängigen Pigmentsynthese von M. furfur identifiziert werden (Mf_Tam1). Das Gen zeigt eine stabile Expression in Tryptophan-Kulturen über einen Zeitraum von 2 Wochen, während es in Arginin-Kulturen nur schwach exprimiert wird. Die in Aminosäuresequenz übersetzte Sequenz zeigte eine starke Ähnlichkeit zu UM01804, dem Schlüsselenzym der Tryptophan-abhängigen Pigmentsynthese aus U. maydis und zu einem hypothetischen Protein aus M. globosa (MGL_2601). Eine weitergehende Überprüfung der genomischen Sequenz von M. globosa zeigt, dass dieser möglicherweise ein Protein besitzt, welches Mf_Tam1 noch weitaus ähnlicher ist, als das als hypothetisches Protein hinterlegte Fragment MGL_2601, und dass überprüft werden muss, ob M. globosa nicht doch zur Pigmentsynthese in der Lage ist, aber die erforderlichen Bedingungen bislang nicht gefunden werden konnten.Die Kenntnis der Gensequenz des wahrscheinlichen Schlüsselenzyms der Tryptophan-abhängigen Pigmentsynthese trägt wesentlich zum Verständnis dieses Stoffwechselweges und zur Entschlüsselung der Pathogenese der PV bei. Der Nachweis des Zusammenhanges zwischen der Tryptophan-abhängigen Pigmentsynthese und der Erkrankung PV könnte zudem therapeutischen Nutzen mit sich bringen. Sollte sich erweisen, dass M. globosa zur Tryptophan-abhängigen Pigmentsynthese befähigt ist, sollten sich Transkripte des Schlüsselgens in Läsionen der PV versicolor nachweisen lassen, und sollte eine Hemmung des Enzyms Mf_Tam1 in vivo zur Besserung der Symptomatik der PV führen, wäre die kausale Beziehung zwischen Tryptophan-abhängiger Pigmentsynthese und der Erkrankung erwiesen, und die Pathogenese einer zwar harmlosen aber stigmatisierenden Erkrankung wäre aufgeklärt. Pityriasis versicolor (PV) is one of the most frequent skin diseases worldwide. It is characterized by the appearance of hyper- and depigmented lesions, a reduced responsiveness to ultraviolet radiation, fluorescence of the lesions under Wood-light (311nm) and a lack of inflammatory reaction despite high fungal load. The pathogenic mechanism responsible for these symptoms is not known yet.Yeasts of the genus Malassezia are the causative agents of the disease. In temperate climate M. globosa is discussed as main agent of PV, while M. furfur is more frequently found on lesional skin in tropical regions. A recently described tryptophan-dependent pigment metabolism of M. furfur might play a role in pathogenesis of PV, as certain compounds possess biological activities providing an explanation for different symptoms of the disease. So far pigments could not be isolated from lesional skin. Furthermore, pigment production could not yet be induced in M. globosa.In the present dissertation molecular tools were developed to analyze the genetics of the tryptophan-dependent pigment metabolism of M. furfur. A putative iron-sulfur-unit of a succinate dehydrogenase of M. furfur (mf_sdh2) was identified, which was used as a housekeeping gene in expression analysis of the pigment associated genes. In future this gene may be needed to develop a first carboxin resistance cassette specific for M. furfur for homologous genetic recombination.Furthermore genetic sequence and open reading frame of the putative key enzyme of tryptophan-dependent pigment production of M. furfur (Mf_Tam1) were identified. This gene shows stable expression in tryptophan cultures over 2 weeks. In arginine culture the gene is scarcely expressed. When translated in protein sequence, a strong similarity was found to UM01804, the key enzyme of tryptophan-dependent pigment production of U. maydis, and to MGL_2601, a hypothetical protein of M. globosa. Analysis of the genomic sequence of M. globosa showed, that M. globosa may posses a gene far more similar to Mf_Tam1 than the hypothetical protein MGL_2601, which bases on a partial mRNA sequence. Hence the question arises, whether M. globosa might be capable of pigment synthesis, if the effective requirements are met.Identification of the genetic sequence of the key enzyme of tryptophan-dependent pigment synthesis is of fundamental significance for understanding the metabolic pathway and for elucidation of the pathogenesis of PV. The existence of a causal relationship between tryptophan-dependent pigment production and the disease might promote the development of new therapy options for PV.Future work is needed to prove such a relationship:If pigment production could be induced in M. globosa, if RNA-transcripts of the key enzyme were isolated from lesions of PV and if an inhibition of the enzyme Tam1 in vivo led to a regression of PV symptoms, the pathogenesis of a yet harmless but stigmatizing disease would be proven.