Der Einfluss von ausgewählten Chromatin-Remodeling-Faktoren und Histonmodifikationen auf die männliche Fertilität

Abstract

HINTERGRUND: Während der Spermatogenese werden die Histone zu 85% durch Protamine ausgetauscht. Es wird angenommen, dass die verbleibenden Histone essentielle Markierungen für die Ausbildung von epigenetischen Informationen im Nachwuchs tragen. Epigenetische Abnormalitäten können im männlichen Genom zu Fehlern nach der Fertilisierung führen. Das Ziel dieser Studie war, das Expressionsmuster von H3K9ac in der Spermatogenese von fertilen und infertilen Männern zu analysieren und das Bindungsmuster an ausgewählte Gene in Ejakulat zu untersuchen. Zusätzlich sollte die Interaktion des BRDT-Gens mit verschieden modifizierten Histonen in Spermien analysiert werden, da angenommen wird, dass Histon-Varianten in die Expression oder Repression von Genen nach der Fertilisierung involviert sind. Des Weiteren wurde das mRNA-Expressionslevel von BRDT untersucht, um Zusammenhänge zwischen epigenetischen Veränderungen, mRNA-Expression und Infertilität aufzudecken.METHODEN: Hodenbiopsien mit normaler und fehlerhafter Spermatogenese, sowie Ejakulate von fertilen und infertilen Männern wurden für Immunhistochemie mit einem H3K9ac-Antikörper verwendet. Des Weiteren wurde Chromatin Immunpräzipitation (ChIP) mit Spermien-DNA von fertilen und infertilen Männern, sowie HeLa-Zellen und Prostata-Gewebe als Kontrollen durchgeführt, unter Benutzung von Antikörpern gegen spezifisch acetylierte und methylierte Histone H3. Anschließend wurde die Assoziation von BRDT und anderen ausgewählten Genen mittels semiquantitativer und real time PCR analysiert. Das BRDT-mRNA-Level wurde mit real time Reverse Transkriptase-PCR untersucht.ERGEBNISSE: Immunhistochemie von H3K9ac zeigte positive Signale in Hodenbiopsien in Spermatogonien A/B, präleptotänen, leptotänen, zygotänen und pachytänen Spermatozyten, runden/elongierten Spermatiden (Stadium III-IV) und reifen Spermien von fertilen und infertilen Männern. H3K9ac war mit Genpromotoren (CRAT, G6PD, MCF2L), Exons (SOX2, GAPDH, STK11IP, FLNA, PLXNA3, SH3GLB2, CTSD) und intergenischen Regionen (TH) in fertilen Männern assoziiert und wies Unterschiede im Verteilungsmuster in HeLa-Zellen, Prostata-Gewebe und Spermien von infertilen Männern auf. Zusätzlich demonstrierten ChIP-Experimente die Kolokalisierung von acetylierten und methylierten Histonen in den Promotor- und Exonregionen des BRDT-Gens in fertilen Männern. Interessanterweise konnte tendenziell eine reduzierte Bindung der untersuchten Histonmodifikationen in dem BRDT-Promotor bei Spermien infertiler Patienten beobachtet werden. Signifikante Unterschiede im mRNA-Expressionslevel von BRDT ließen sich zwischen einer Gruppe von fertilen Spendern und einer Gruppe infertiler Patienten nachweisen. SCHLUSSFOLGERUNGEN: Das Vorhandensein von H3K9ac in männlichen Keimzellen lässt auf eine wichtige Rolle für die Spermienentwicklung schließen. Des Weiteren ist H3K9ac mit verschiedenen Genregionen im Spermiengenom assoziiert, was auf eine Funktion als epigenetische Markierung schließen lässt, die in den Embryo übertragen werden könnte und somit die Gene beeinflussen würde, die zuerst nach der Fertilisierung transkribiert werden. Zusätzlich konnte gezeigt werden, dass die epigenetische H3K9ac-Markierung an bestimmten Genen in infertilen Männern verändert ist. Zudem zeigen diese Daten, dass BRDT eine bedeutende Funktion für die Spermienentwicklung, Fertilisierung und eventuell die frühe Embryonalentwicklung haben könnte, da Spermien bedeutende Mengen an BRDT-mRNA besitzen und der Promotor und die kodierende Region des BRDT-Gens mit modifizierten Histonen assoziiert ist, die als epigenetische Markierungen dienen könnten. BACKGROUND: During spermatogenesis, histones are replaced by protamines to about 85%. It has been proposed that the remaining histones might carry essential marks for the establishment of epigenetic information in the offspring. Epigenetic abnormalities in the male genome may cause post fertilisation errors. The aim of the study was to analyze the expression pattern of H3K9ac in spermatogenesis of fertile and infertile men and the binding pattern to selected genes in ejaculates. In addition, the interaction between the BRDT gene and differentially modified histones in human spermatozoa was analyzed, as histones variants has been suggested to be involved in gene expression or repression after fertilization. The mRNA level of BRDT has been studied in order to find correlations between epigenetic changes, mRNA level and infertility.METHODS: Testicular biopsies with normal and impaired spermatogenesis, as well as ejaculates of fertile and infertile men were used for immunohistochemistry with H3K9ac antibody. Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) was performed with sperm DNA of fertile and infertile men and as controls, HeLa cells and prostate tissue using antibodies against specifically acetylated and methylated histones H3. The binding of BRDT and other selected genes was evaluated by semiquantitative and real time PCR. The BRDT mRNA level was screened by real time reverse transcriptase PCR.RESULTS: Immunohistochemistry of H3K9ac demonstrated positive signals in testicular biopsies in spermatogonia A/B, preleptotene, leptotene, zygotene and early pachytene (stage I-III) spermatocytes as well as round/elongating spermatids (stage III-IV) and mature sperm of fertile and infertile men. H3K9ac was associated with gene promoters (CRAT, G6PD, MCF2L), exons (SOX2, GAPDH, STK11IP, FLNA, PLXNA3, SH3GLB2, CTSD) and intergenic regions (TH) in fertile men and exhibited shifts of the distribution pattern in HeLa cells, prostate tissue and sperm of infertile men. In addition, ChIP assay revealed co-localization of acetylated and methylated histones within promoter and exon regions of the BRDT gene in fertile men. Interestingly, by trend, reduced binding of the investigated histone modifications was observed in the BRDT promoter of infertile patients. Significant differences of the BRDT mRNA level have been detected between a group of fertile donors and infertile patients.CONCLUSIONS: H3K9ac presence in male germ cells indicates an important role during development of sperm. Furthermore, we suggest that H3K9ac is associated with specific regions of the sperm genome, defining an epigenetic code, which could be transmitted to the embryo and might influence which genes are first transcribed after fertilization. In addition, we could demonstrate that the epigenetic code might be disturbed in ejaculated sperm of infertile patients. In addition, data from the present study suggest that BRDT has an important function in fertilization and/or early embryo development, as sperm cells contain high levels of BRDT mRNA and both the promoter and coding region of the BRDT gene is associated with modified histones representing epigenetic marks.