Inhibition of HIF prolyl 4-hydroxylases protect endothelial cells from apoptosis

Abstract

In the present study a new approach against the ongoing apoptotic cell death duringhypoxia/reoxygenation (H/R) in endothelial cells was established. Particularly, theactivation of hypoxia-inducible factor (HIF-1alpha), plays an essential role in triggeringcellular protection during hypoxia, but it s rapidly degradation during reoxygenation, maylimit its effect on cell survival to the hypoxic period alone. Regulation of HIF-1alphaexpression is controlled by repression of oxygen-dependent prolyl 4-hydroxylases (PHD)during hypoxia. The present study was conducted to elucidate the molecular mechanismby which inhibition of PHD pathway leads to protection of endothelial cells againstongoing apoptotic cell death during H/R. The study was performed using an establishedmodel of cultured monolayers of human umbilical vein endothelial cells to test thehypothesis that stabilization of HIF-1alpha beyond hypoxia exerts anti-apoptotic effectsduring H/R by preventing p53-mediated apoptosis.Cells were serum starved for 12 h, then exposed to 1 h of hypoxia (Po2 < 5mmHg)followed by 24 h of reoxygenation (Po2=140mmHg). Exposure to hypoxia caused anincrease in HIF-1alpha and p53 content. During reoxygenation HIF-1alpha declined towardsbasal level, while p53 remained unaltered. Under the same conditions, endothelialapoptosis was increased to 58% (annexin V staining). Silencing of PHD2, led to anincrease of the HIF-1alpha content during hypoxia and maintained it at that level duringreoxygenation. HIF-1alpha stabilization was associated by an increase in the Mdm2 content,whereas expression of p53 was reduced. PHD2 silencing reduced apoptosis to half.Additon of DMOG (1mM, dimethyloxalyl glycine), a PHD inhibitor, at the onset ofreoxygenation had the same effect. Reduction of p53 content was restored when theproteosome inhibitor MG-132 was added. Interaction of Mdm2 and p53 (coimmunoprecipitation)was increased compared to reoxygenation. Downregulation of HIF-1alpha by siRNA increased apoptosis to 60% and abrogated Mdm2-p53 complex formation.Downregulation of Mdm2 by siRNA had no effect on HIF-1alpha but increased p53 level.Stabilization of HIF-1alpha due to PHD inhibition beyond the period of hypoxia defines anovel mechanism that exerts anti-apoptotic effects during H/R injury by preventing p53-mediated apoptosis and identifies PHD2 as a new molecular target for therapeuticintervention. In der vorliegenden Studie wurde eine neue Methode gegen die anhaltende Apoptosewährend der Hypoxie/Reoxygenierung (H/R) in Endothelzellen (EC) etabliert. DieAktivierung des Hypoxie-induzierten Faktors (HIF-1alpha) spielt eine besondere Rolle in derAuslösung zellulärer Schutzmechanismen bei Hypoxie, welcher bei Reoxygenierungjedoch schnell zersetzt wird, so dass diese Rolle vermutlich auf die hypoxische Phasebeschränkt ist. Die HIF-1alpha;-Expression wird durch die Hemmung dersauerstoffabhängigen Prolyl 4-Hydroxylasen (PHD) während der Hypoxie reguliert.Diese Studie wurde durchgeführt, um den molekularen Mechanismus zu finden, derdurch die Hemmung des PHD-Weges zum Schutz der EC vor Apoptose nach H/R führt.Diese Studie nutzte ein etabliertes Modell in humanen Endothelzellen derNabelschnurvene, um die Hypothese zu testen, ob die Stabilisierung von HIF-1alpha nachder Hypoxiephase anti-apoptotische Effekte während der H/R Schädigung aufzeigt,indem die p53-vermittelte Apoptose gehemmt wird.Hierfür wurde den Zellen zunächst für 12 Stunden das Serum im Kulturmediumentzogen. Anschließend wurden die EC für eine Stunde einer Hypoxie gefolgt von 24Stunden Reoxygenierung ausgesetzt. Die Hypoxie verursachte einen Anstieg von HIF-1alpha und p53. Während der Reoxygenierung fiel HIF-1alpha auf niedrige Konzentrationen ab,doch die p53 Konzentration blieb unverändert. Unter den gleichen Bedingungen stiegdie Apoptoserate der EC auf 58% (Annexin V Färbung). Das Ausschalten des PHD2-Gens führte zu einem Anstieg an HIF-1alpha während der Hypoxie und gleich hohem HIF-1alpha-Gehalt bei der Reoxygenierung. Die Stabilisierung des HIF-1alpha war assoziiert miteinem Anstieg an Mdm2 und einer verringerten Exprimierung von p53. Das Ausschaltendes PHD2-Gens führte zu einer Halbierung der Apoptoserate. Der Zusatz von DMOG(1mM, Dimethyloxalyl glycin), einem PHD Inhibitor, zu Beginn der Reoxygenierungzeigte den gleichen Effekt. Die Reduktion des p53 wurde durch den Proteosomeninhibitor MG-132 aufgehoben. Die Interaktion zwischen Mdm2 and p53 (Coimmunopräzipation)war im Vergleich mit der Reoxygenierung erhöht. Downregulationvon HIF-1alpha siRNA erhöhte die Apoptoserate auf 60% und hob die Mdm2-p53-Komplexbildung auf. Downregulation von Mdm2 durch siRNA zeigte keinen Effekt aufHIF-1alpha, erhöhte jedoch die Konzentration an p53. Die Stabilisierung von HIF-1alpha über dieHypoxiephase hinaus zeigt einen neuen Schutzmechanismus vor einer endothelialenH/R-Schädigung auf. Dieser Protektionsmechanismus beruht auf einer Inhibition derp53-vermittelten Apoptose und identifiziert PHD2 als ein neues molekulares Ziel für dietherapeutische Intervention.