Die Rolle von Intermedin in der Schrankenfunktion mikrovaskulärer koronarer Endothelzellen

Abstract

Das Gefäßendothel nimmt als homogene Zellschicht neben der Regulation von Gefäßtonus, Blutfließeigenschaften sowie der Koagulation und Thrombusbildung eine bedeutende Rolle in der Steuerung der Barrierefunktion ein.Intermedin, ein 2004 entdecktes neues Mitglied der Calcitonin-Peptid-Familie spielt eine wichtige Rolle in der Regulation der endothelialen Barrierefunktion. Ziel dieser Arbeit war die Identifizierung des molekularen Mechanismus, über den Intermedin die Schrankenfunktion beeinflusst.Im Mittelpunkt der Untersuchungen standen dabei die Fragen nach der Signaltransduktion und der Wirkung, welche Intermedin auf das endotheliale Zytoskelett hat.Zur Beantwortung dieser Fragen wurden an kultivierten einschichtigen Ratten-Endothelzellen die Wirkung von Intermedin auf die endotheliale Permeabilität, CGRP-Rezeptoren, RhoA, ROCK, das Aktin-Zytoskelett und die kontraktile Aktivierung untersucht.Stimulation von Endothelzellen mikrovaskulären Ursprungs mit Intermedin führte bereits bei einer Konzentration von 0,1 nM zu einer signifikanten Steigerung der Makromolekülpermeabilität, begleitet von einer Abnahme der RhoA-Aktivität sowie der kontraktilen Aktivität. Durch den gezielten Einsatz des panspezifischen IMD-Rezeptorantagonisten alfa-CGRP8-37 und des PKA-Hemmstoffs H89 konnte gezeigt werden, dass Intermedin seine Wirkung auf die intrazelluläre Signaltransduktion über spezifische CRLR/RAMP-Rezeptor-Komplexe vermittelt und dabei Endothelzellen über den cAMP/PKA-Weg aktiviert. Ebenfalls fand sich nach Gabe des Rho-Inhibitors C3T oder des ROCK-Inhibitors Y27632 eine dem Intermedin äquipotente Wirkung auf die endotheliale Permeabilität.Des Weiteren konnte gezeigt werden, dass Intermedin über eine Dephosphorylierung des Aktin-bindenden-Proteins Kofilin die Deassemblierung von F-Aktin und somit eine Destabilisierung des Aktinzytoskeletts bewirkt.Damit präsentiert diese Arbeit Intermedin als einen neuen potenten Regulator der endothelialen Barrierefunktion. The vascular endothelium is a homogenous cell layer and plays a considerable role in the control of endothelial barrier function, regulation of the vascular tone, characteristics of blood flow, as well as coagulation and formation of blood clots. Intermedin was discovered in 2004 as a new member of the calcitonin / CGRP family, and it has a significant influence on the regulation of the endothelial barrier function. The aim of this study was to identify the molecular mechanisms through which intermedin affects the vascular endothelium.The focus of the investigations was laid on the signalling pathways which are activated by intermedin and their effect on the endothelial cytoskeleton. In order to answer this questions, rodent endothelial cells were exposed to intermedin, in vitro, and the changes in the endothelial permeability, the CGRP-receptor, RhoA, ROCK, the actin cytoskeleton and the contractile activation were analysed.Exposure to intermedin led to a rapid increase in the endothelial macromolecule permeability already at a concentration of 0.1 nM. Intermedin also induced a reduction in RhoA and contractile activity.Usage of the pan-specific intermedin receptor antagonist alfa-CGRP8-37 and the protein kinase inhibitor H89 revealed that intermedin mediates its effect on the intracellular signal transduction via specific CRLR/RAMP receptor complexes which then activate endothelial cells via the cAMP/PKA pathway. Furthermore, administration of the Rho-inhibitor C3-transferase and the ROCK-inhibitor Y27632 demonstrated an equally potent effect on endothelial permeability as intermedin.In addition, intermedin caused a depletion of actin fibres via dephosphorylation of the actin-binding-protein Cofilin causing the destabilization of the actin cytoskeleton. Thus, the present study reveals intermedin as a new potent regulator of the endothelial barrier function.