TIAR and TIA-1 mRNA binding proteins co-aggregate under conditions of rapid oxygen decline and extreme hypoxia, suppress HIF-1alpha pathway and inhibit proliferation and angiogenesis

Abstract

T-cell intracellular antigen (TIA)-1 and TIA-1 related protein (TIAR) are mRNA-binding proteins that aggregate within stress granules under specific stress conditions. In this study, we analyzed TIAR/TIA-1 aggregation under different hypoxic conditions, and studied the effects on hypoxia-inducible factor (HIF)-1alpha, as well as on proliferation and angiogenesis. TIAR/TIA-1 formed stress granules under acute and pronounced hypoxic conditions in A549 adenocarcinoma cells. In parallel, HIF-1alpha expression was blocked in cells displaying TIAR/TIA-1 stress granules. Silencing of TIAR and TIA-1 caused upregulation of HIF-1alpha expression, as demonstrated by western blot, immunocytochemistry, and HIF-1alpha-dependent reporter gene expression. TIAR/TIA-1 are suggested to mediate their effects by interaction with certain mRNA regions. Thus, a critical region of the 3 end of the untranslated HIF-1alpha cDNA with possible adenosine-uridine rich (AUR) elements was coupled to a reporter gene plasmid. Indeed, this coupling caused downregulation of the reporter gene expression, supporting the relevance of this mRNA region for the effects of TIAR/TIA-1 exerted on HIF-1alpha. Furthermore, employing this reporter construct inhibition of TIAR by siRNA attenuated the inhibitory cis-effect of this AUR sequence. Additionally, immunohistochemical analysis of A549 cell tumor xenografts revealed a nearly complementary expression of HIF-1alpha and TIAR. This in vivo observation may reflect the inhibitory regulation of HIF-1alpha by TIAR as revealed in the cell culture studies. In sum, rapid and severe hypoxia caused TIAR/TIA-1-dependent formation of stress granules, specifically suppressing HIF-1alpha expression. Additionally TIAR/TIA-1 was demonstrated to exhibit inhibitory effects on proliferation and angiogenesis. T-cell intracellular antigen (TIA)-1 und TIA-1 related protein (TIAR) sind mRNA-bindende Proteine, welche unter bestimmten Stressbedingungen zu Stressgranula aggregieren. In dieser Arbeit wurde die Aggregation von TIAR/TIA-1 unter verschiedenen Hypoxie Bedingungen analysiert. Zudem wurde der Effekt auf den Hypoxie-induzierbaren Faktor (HIF-1alpha) sowie auf Proliferation und Angiogenese in humanen Adenokarzinomzellen (A549) untersucht.TIAR/TIA-1 formten Stressgranula unter akuten und extremen Hypoxiebedingungen. In Zellen mit TIAR/TIA-1-haltigen Stressgranula war keine Expression von HIF-1alpha nachweisbar. Inhibition der Expression von TIAR und TIA-1 mit siRNA verursachte eine Hochregulation von HIF-1alpha. Diese wurde nachgewiesen durch Western Blot, Immunzytofluoreszenz und HIF-1alpha-abhängige Reportergen Expression. Die Effekte von TIAR/TIA-1 werden vermutlich durch Interaktion mit bestimmten mRNA Sequenzen vermittelt. Daher wurde eine kritische Region des 3 -Endes der nicht translatierten HIF-1alpha cDNA mit möglichen Adenosin-Uridin reichen (AUR) Elementen an ein Reportergen Plasmid gekoppelt, was eine Herunterregulation der Expression des Reportergens bewirkte. Diese Beobachtung stützt die Relevanz dieser mRNA Sequenz für die beobachteten Effekte von TIAR/TIA-1 auf HIF-1alpha. Ferner führte die Inhibition von TIAR mit siRNA beim Einsatz dieses Reporterkonstruktes zur Abschwächung des inhibitorischen cis-Effektes der AUR-Sequenz. Interessanterweise zeigte in weiteren Experimenten, die Analyse von A549 Xenotransplantaten durch Immunhistofluoreszenz eine nahezu komplementäre Expression von HIF-1alpha und TIAR an. Diese in vivo Beobachtung ist stimmig mit der inhibierenden Regulation von HIF-1alpha durch TIAR, wie sie in den Zellkulturstudien beobachtet wurde.Zusammenfassend verursacht akute und extreme Hypoxie die TIAR/TIA-1-abhängige Bildung von Stressgranula mit spezifischer Unterdrückung der HIF 1alpha Expression. Außerdem konnten für TIAR/TIA-1 inhibitorische Effekte auf Proliferation und Angiogenese nachgewiesen werden.