Urokinase-Rezeptor (uPAR) und Zellkontakte : Mechanismen uPAR-abhängiger Zelladhäsion, Zellmigration und Signaltransduktion

Abstract

Das uPA (Urokinase)-/ uPAR (Urokinaserezeptor)- System ist primär als Fibrinolysesystem bekannt, stellt jedoch zusätzlich ein multifunktionelles System mit einem breitem Einflussspektrum auf inflammatorische Prozesse, Gefäßerkrankungen und Karzinomleiden dar. Diese Arbeit beschäftigt sich vorrangig mit den zellulären Funktionen des uPA-/uPAR-Systems. Hierbei wird die Bedeutung des Urokinaserezeptors für die Zelladhäsion nicht nur im Hinblick auf die Integrin-regulierenden Funktionen, sondern auf uPAR als direkter Ligand für das Matrixprotein Vitronektin herausgestellt. Über die Bindung von uPAR an Vitronektin werden stabile Adhäsionskomplexe formiert, welche von der Akkumulation der beteiligten Proteine, u.a. uPAR, Vinculin und Aktin, sowie Signalproteinen wie Src- Kinasen und inhibitorischen G- Proteinen in Lipiddomänen abhängt. Eine Beteiligung von Integrinen an der uPAR- vermittelten Zelladhäsion auf Vitronektin kann in dieser Arbeit weder in Adhäsionsassays, noch in isolierten Adhäsionskomplexen gefunden werden, sodass hierfür ein eigenständiger Mechanismus der Zell- Matrix- Interaktion angenommen werden muss.Eine weitere Fragestellung der Arbeit bezieht sich auf die Urokinase- induzierte Zellmigration glatter Gefäßmuskelzellen. Diese zeigt eine deutliche Abhängigkeit von der Ligand- Rezeptorinteraktion mit dem typischen uPA- Rezeptor, wohingegen die proteolytische Aktivität der Urokinase für die Stimulation der Zellmotilität nicht erforderlich ist. Mittels Signalaktivierungsuntersuchungen und Western-Blottanalysen wird gezeigt, dass die chemotaktische Wirkung der Urokinase auf der parallelen Aktivierung mehrerer, zellspezifischer Signalkaskaden beruht. Hieran beteiligt sind inhibitorische G- Proteine mit Aktivierung der PLC. Letzteres führt zur intrazellulären Ca2+- Erhöhung, wodurch eine Voraussetzung für die Aktivierung von Ca2+/ Calmodulinkinasen geschaffen wird. Unabhängig davon übt die Aktivierung der PI-3K wichtigen Einfluss auf die HVSMC- Migration aus, wohingegen der ERK 1/2- Signalweg keinerlei Einfluss hat. uPA- stimulierte HVSMC- Migration einschließlich der Signalaktivierung setzt die Akkumulation des Rezeptors in Lipiddomänen voraus. Eine Behandlung der Zellen mit Cholesterol- lösenden Substanzen wie MBCD führt zur Hemmung der Zellmigration wie auch der Signalaktivierung aufgrund der Zerstörung der lipid rafts.Aufgrund der fehlenden transmembranären Domäne von uPAR ist die Signalkette zwischen der uPAR-/ uPA- Interaktion und zytosolischen Proteinen noch nicht vollends geklärt. Möglicher Mechanismus ist die Verwendung transmembranärer Adapterproteine, welche jedoch noch nicht identifiziert werden konnten. The urokinase type plasminogen activator system serves as a multifunctional protease system and plays a role in many different cellular functions such as cell adhesion, migration and signaltransduction. Thereby it may influence a number of pathological and physiological functions. In this study we provide evidence for the integrin independent but uPAR-dependent cell adhesion on the matrix protein vitronectin, which serves as a direct binding partner for uPAR. uPAR accumulates in lipid rafts together with putative adaptor molecules as well as with cytoskelettal components such as vinculin and actin, and signaling proteins like Src- kinases and Gi- Proteins. Integrins could not be found in these detergent insoluble adhesion plaques, indicating that uPAR- mediated lipid raft formation does not require integrin- clustering. Thus uPAR dependent cell- adhesion on vitronectin represents a mechanism distinct from usual integrin- dependent cell- matrix- interaction.Referring to uPA- stimulated migration of human vascular smooth muscle cells (HVSMC) the chemotactic response was not dependent on proteolytic activity, since the active as well as the catalytically inactive uPA showed a similar effect on cell migration, but it requires ligand- receptor binding to the common uPAR. Furthermore the chemotacitc response after stimulation with uPA was dependent on the activation of different signalling pathways. These include the activation of inhibitory G- proteins, with its different downstream pathways, implicating the inhibition of adenylylcyclase as well as the activation of PLC and thus an intracellular increase of Ca2+, which is necessary for activation of Ca/ Calmodulinkinases. The activation of PI-3K is also important for uPA-/ uPAR- mediated HVSMC migration, whereas activation of the ERK 1/2 pathway occures after stimulation with uPA, but has no influence on migration. As already described for uPAR- mediated cell adhesion on vitronectin, HVSMC migration and signaltransduction depends on uPAR accumulation in lipid rafts, since cholesterol depleting agents such as MBCD completely abolish the stimulating effect. In which way uPA binding to uPAR manages to transfer a signal from outside to inside the cell in spite of missing a transmembrane domain is still not fully understood.