Lichtmikroskopische Charakterisierung der intrazellulären Lokalisation der Kinase HIPK2 anhand verschiedener Gen-Mutanten

Abstract

Die Dissertation untersucht die intrazelluläre Lokalisation der Kinase HIPK2. Diese Abkürzung steht für homeodomain-interacting protein kinase 2.Der erste Teil der Dissertation befasst sich mit der fluoreszenzmikroskopischen Darstellung der endogenen HIPK2. Diese Serin/Threonin-Kinase befindet sich überwiegend im Zellkern in Speckles. Der Vergleich unterschiedlicher Fixierungsmethoden zeigte, dass die besten Färbungen durch die Fixierung mit 4 %igem Paraformaldehyd in Kombination mit 0,1 %igem beziehungsweise 0,3 %igem Triton X-100 erzielt wurden. Da die Lokalisation der HIPK2 in nuklearen Speckles von der Kinaseaktivität abhängt, wurden unterschiedliche HIPK2-Punktmutanten bezüglich ihrer intrazellulären Verteilung untersucht. Dazu wurden HIPK2-Varianten mit Mutationen in den phosphorylierbaren Aminosäuren der Aktivierungsschleife in Zellen exprimiert und mittels Fluoreszenzmikroskopie dargestellt. Die Auswirkungen der verschiedenen Mutationen auf die Lokalisation von HIPK2 waren sehr unterschiedlich. Des Weiteren wurde die intrazelluläre Verteilung der Kinase in unterschiedlichen Phasen des Zellzyklus fluoreszenzmikroskopisch dargestellt, da HIPK2 unter anderem an der Regulation des Zellzyklus beteiligt ist. Hierbei zeigte sich für den HIPK2-Wildtyp vom Beginn der S- bis in die G2-Phase hinein eine Abnahme der Zellen, die ausschließlich Speckles im Kern bilden, um 24 %. Gleichzeitig stieg in diesem Zeitraum der Anteil der Zellen, die eine diffuse Verteilung von HIPK2 im Kern aufweisen, um 22 % an. Untersuchungen zur Zellzyklusregulation der intrazellulären Verteilung von HIPK2-Varianten mit Punktmutationen in der Aktivierungsschleife wiesen keine Unterschiede zur Verteilung im Vergleich zur Wildtyp-Kinase auf. Diese Ergebnisse zeigen, dass die Zellzyklus-regulierte Verteilung der HIPK2 nicht durch Phosphorylierungsereignisse innerhalb der Aktivierungsschleife reguliert wird, sondern durch andere Mechanismen die in zukünftigen Studien untersucht werden können. This thesis focuses on the intracellular exposition of the protein kinase HIPK2. HIPK2 is the abbreviation for homeodomain-interacting protein kinase 2.The first part of this thesis gives attention to the exposition of the endogenous HIPK2 via fluorescence microscopy. This serine/threonine kinase is mainly found within the nucleus, accumulated to speckles. The comparison of different fixation methods showed that the best staining was achieved by fixing the cells with 4 % paraformaldehyde combined with 0,1 % or 0,3 % Triton X-100. Since the accumulation of HIPK2 to nuclear speckles is regulated by its kinase activity, the different HIPK2 point mutants were analyzed concerning their intracellular spreading. For this purpose HIPK2 variants with mutations of the amino acids within the activation loop that can be phosphorylated were expressed in cells and analyzed using immunofluorescence. The effects of the different mutations upon the intracellular localization of HIPK2 were very variable. Since HIPK2 is able to regulate the cell cycle, the intracellular spreading of the kinase was investigated during the different phases of the cell cycle using immunofluorescence. For the HIPK2-wild type it showed from the entrance of the S-phase until the G2-phase a decrease of cells with exclusively nuclear speckles from about 24 %. During the same time, the proportion of cells with a diffuse spreading of HIPK2 within the nucleus increases about 22 %. Investigations about the cell cycle regulation of the intracellular localization of HIPK2-variants with point mutations within the activation loop showed no differences concerning the intracellular spreading compared to the wild type kinase. These results show that the changes of the intracellular localization of HIPK2 during the cell cycle are not regulated by phosphorylation events within the activation loop, but have to be controlled by other mechanisms that should be explored in further studies.