Hypoxic regulation and selective silencing of pyruvate kinase isoforms PKM1 and PKM2 by siRNA

Abstract

PKM1 and PKM2 represent two splice variants of the glycolytic enzyme pyruvate kinase thatdiffer in the inclusion of exon 9 or exon 10, respectively. PKM2 appears to be highlyexpressed in tumor cells and is suggested to favor the Warburg effect that is characterized byhigh glycolytic activity of tumor cells.In the first part of the thesis, we analyzed the regulation of PKM1 and PKM2 under normoxicand hypoxic conditions in different tumor cell lines from lung (A549) and prostate (PC3 andLNCaP). Furthermore, we investigated whether HIF-1alpha and HIF-2alpha are relevant for hypoxicregulation of PKM1 and PKM2.At the mRNA level, PKM1 and PKM2 were expressed in all cell lines studied. PKM2displayed significant upregulation under hypoxic conditions in all cell lines studied, whereasPKM1 mRNA was only increased significantly under hypoxic conditions in LNCaP cells. Atthe protein level, PKM2 expression was upregulated significantly in LNCaP cells in hypoxiaand to some extent in A549 cells that did not reach significance. No change of the PKM2protein level was observed in PC3 cells in hypoxia. Silencing of HIF-1alpha and HIF-2alpha did notshow any effect on PKM2 mRNA and protein expression levels in A549 and PC3 cells.However, HIF-1alpha dependent upregulation of PKM2 was observed at the mRNA and proteinlevel in LNCaP cells in hypoxia.Since HIF-1alpha is a mediator of the Warburg effect, we next analyzed a possible role of PKM2on the HIF-1alpha pathway. Interestingly, silencing of PKM2 decreased HRE activation in A549and PC3 cells, whereas HIF-1alpha protein levels were not significantly reduced after silencing ofPKM2, suggesting that HIF-1alpha dependence on PKM2 is mediated at the transactivation level.LNCaP cells responded differently in this regard, whereas no effect was observed aftersilencing of PKM2. Silencing of PKM1 increased HRE activation in these cells, an effect thatalso was observable only at the transactivation but not at the protein level of HIF-1alpha.PKM1 and PKM2 were further functionally characterized with respect to clonogenic survival.Silencing of PKM2, but not PKM1, significantly reduced clonogenic survival in all cell linesstudied, confirming the role of PKM2 in tumorigenesis in contrast to PKM1.In conclusion, we revealed that PKM2 was upregulated at the mRNA level in hypoxia in allcell lines studied. At the protein level, this effect became obvious only in LNCaP cells andwas dependent on HIF-1alpha in these cells. Vice verse, PKM2 appears to have an effect on HIF-1alpha transactivation in two from three cell lines studied. Thus, PKM2 may contribute to theWarburg effect by induction of HIF dependent signal transduction in at least some cancer celllines. PKM2 has strong effects on tumorigenesis to a similar extent in all cell lines studied. PKM1 und PKM2 repräsentieren zwei Spleißvarianten des glykolytischen EnzymsPyruvatkinase, die sich jeweils durch die Inklusion von Exon 9 oder Exon 10 unterscheiden.PKM2 scheint in Tumorzellen hoch exprimiert zu werden und begünstigt den Warburg-Effekt, der durch eine hohe glykolytische Aktivität in Tumorzellen charakterisiert ist.Im ersten Teil der Arbeit, analysierten wir die Regulation von PKM1 und PKM2 unternormoxischen und hypoxischen Bedingungen in verschiedenen Tumor-Zelllinien aus Lunge(A549) und Prostata (PC3 und LNCaP). Darüber hinaus wurde untersucht, ob HIF-1 alpha undHIF-2alpha relevant für eine Induktion von PKM1 und PKM2 in Hypoxie sind.Auf mRNA Ebene wurden PKM1 und PKM2 in allen untersuchten Zelllinien exprimiert.PKM2 zeigte eine signifikante Hochregulation in Hypoxie in allen untersuchten Zelllinienwährend PKM1 mRNA nur in LNCaP-Zellen signifikant erhöht war. Auf Protein-Ebene wardie PKM2 Expression in LNCaP-Zellen in Hypoxie signifikant erhöht und in geringeremMaße Grad in A549 Zellen ohne signifikant zu sein. In PC3-Zellen war keine Änderung vonPKM2 Protein in Hypoxie zu beobachten. Silencing von HIF-1alpha; und HIF-2alpha zeigte keineAuswirkungen auf PKM2 mRNA- und Protein-Expression in A549 und PC3 Zellen.Allerdings wurde eine HIF-1alpha abhängige Induktion von PKM2 auf mRNA-und Protein-Ebenein LNCaP-Zellen in Hypoxie beobachtet.Da HIF-1 alpha ein Vermittler des Warburg-Effekt ist, analysierten wir als nächstes eine möglicheRolle von PKM2 auf HIF-1 abhängige Signaltransduktion. Interessanterweise verringerteSilencing von PKM2 die HRE-Aktivierung in A549 und PC3 Zellen, während die HIF-1alpha-Protein-Spiegel nicht signifikant reduziert waren, was darauf hindeutet, dass PKM2 dieTransaktivierung von HIF-1 alpha begünstigt. LNCaP-Zellen reagierten in dieser Hinsichtunterschiedlich. Während kein Effekt nach Silencing von PKM2 auf die die HRE-Aktivierunggefunden wurde, erhöhte Silencing von PKM1 die HRE-Aktivierung in diesen Zellen ohne,dass die HIF-1alpha Protein-Spiegel geändert waren.PKM1 und PKM2 wurden weiter funktionell in Bezug auf ihr klonogenes Überlebencharakerisiert. Silencing von PKM2 aber nicht PKM1 reduzierte das klonogene Überleben inallen untersuchten Zelllinien deutlich und bestätigte so die Rolle von PKM2 im Gegensatz zuPKM1 in der Tumorgenese.Zusammenfassend lässt sich sagen, dass wir eine PKM2 Hochregulation auf mRNA-Ebene inHypoxie in allen untersuchten Zelllinien nachweisen konnten. Auf Protein-Ebene wurdedieser Effekt nur in LNCaP-Zellen offenbar und war abhängig von HIF-1 alpha in diesen Zellen.Umgekehrt hatte PKM2 eine positive Wirkung auf die Transaktivierung von HIF-1 alpha in zweivon drei Zelllinien. So könnte PKM2 durch die Induktion HIF abhängiger Signaltransduktionzumindest in einigen Tumorzellen zum Warburg-Effekt beitragen. PKM2 zeigte eine starkeAuswirkung auf die Tumorgenese in den untersuchten Tumorzelllinien.