Herkunft und Proliferation von Alveolarmakrophagen nach experimenteller Lungentransplantation in der Ratte

Abstract

Die Alveolarmakrophagen spielen eine wichtige Rolle bei der akuten Abstoßung von Lungentransplantaten. Beim Menschen ist ein persistierender Chimärismus in einigen Studien über Untersuchungen an bronchoalveolärer Lavageflüssigkeit und transbronchialen Biopsien nachgewiesen. Studien, die die Herkunft der Alveolarmakrophagen nach allogener Lungentransplantation in der Ratte in den Alveolen beschreiben, fehlen jedoch. Desweiteren findet sich bereits in der frühen Phase der Abstoßung ein starker Anstieg der Makrophagenanzahl im Infiltrat. Ursächlich hierfür könnte zum einen eine verstärkte Rekrutierung von Monozyten aus dem Blut oder die Proliferation und Differenzierung von interstitiellen Makrophagen sein. Zum anderen kommen eine verminderte Elimination aus dem Alveolarraum und den Atemwegen oder eine Proliferation der Makrophagen in den Alveolen in Frage. In der vorliegenden Arbeit untersuchten wir die Herkunft und das Proliferationsverhalten von Alveolarmakrophagen im Lungentransplantat der Ratte.Es wurden orthotope, linksseitige Lungentransplantationen in der isogenen LEW auf LEW und der allogenen DA auf LEW Rattenstammkombination durchgeführt. Um die Makrophagenherkunft über das Y-Chromosom zu klären, wurden zusätzlich die Lungen weiblicher Spender auf männliche Empfänger transplantiert. Zunächst bestimmten wir den Anteil der MHC Klasse II-positiven Alveolarmakrophagen über eine immunhistochemische Doppelfärbung mit den monoklonalen Antikörpern ED1 und OX6. Es zeigte sich, dass an Tag drei und vier nach Transplantation etwa ein Viertel der Alveolarmakrophagen MHC Klasse II exprimierten. Im Weiteren stellten wir mittels Doppelfärbung mit den monoklonalen Antikörpern ED1 und OX76 den Anteil der MHC Klasse II-Positiven Alveolarmakrophagen vom Spendertyp fest. Dieser lag bei etwa 10% an Tag drei und 7% an Tag vier. Hieraus berechneten wir, dass am dritten Tag nach der Transplantation 40% und am vierten Tag 24% der MHC Klasse II-positiven Alveolarmakrophagen vom Transplantatspender stammen. Mit Transplantationen von weiblichen Spenderorganen auf männliche Empfänger konnten wir über die Bestimmung des Y-Chromosoms mittels ISH und Färbung mit dem monoklonalen Antikörper ED1 feststellen, dass am vierten Tag nach der Transplantation 55% der Alveolarmakrophagen in der allogen transplantierten Lunge vom Spender stammen. Im isogenen Transplantat betrug der Wert 73%.Um die Zellen zu detektieren, die sich in der S-Phase des Zellzyklus befinden, injizierten wir den Tieren 30 min vor der Tötung am zweiten Tag nach der Transplantation BrdU. Der Einbau von BrdU bei der DNA-Synthese wurde für die Alveolarmakrophagen mittels Doppelfärbung mit den monoklonalen Antikörpern ED1 und Bu20a und für die interstitiellen Makrophagen mittels Doppelfärbung mit den monoklonalen Antikörpern ED2 und Bu20a sichtbar gemacht. So zeigte sich, dass etwa 5% der Alveolarmakrophagen nicht transplantierter Tiere DNA synthetisieren. Bei den transplantierten Tieren befanden sich bis zu 21% der Alveolarmakrophagen in DNA-Synthese, unabhängig ob allogen oder isogen transplantiert wurde. Für die interstitiellen Makrophagen betrug der Wert 10%.Wir konnten nachweisen, dass bei den Alveolarmakrophagen im allogenen Lungentransplantat der Ratte ein anhaltender Chimärismus besteht. Darüber hinaus zeigten wir, dass die Transplantation bei den Alveolarmakrophagen verstärkt Proliferation induziert. Dies trifft ebenso, wenn auch in geringerem Maße für die interstitiellen Makrophagen zu. Vergleichbar hohe Proliferationsraten sind bislang nicht beschrieben worden. Es ist daher davon auszugehen, dass die Proliferation wesentlich zur Vermehrung der Alveolarmakrophagen beiträgt, welche nach der isogenen und allogenen Lungentransplantation zu beobachten ist. Alveolar macrophages are involved in acute lung allograft rejection. After lung transplantation in humans, chimerism is shown in some studies investigating bronchoalveolar lavage fluid or transbronchial biopsies. Studies investigating the origin of alveolar macrophages in rat lung allografts, however, are missing. Early after allogeneic transplantation, the population of alveolar macrophages increases in number. This might be due to an increased recruitment of blood monocytes, proliferation and migration of peribronchial and perivascular macrophages, to slowing down their elimination from the airways or to proliferation of the alveolar macrophages in situ. It is not known, if proliferation in situ can significantly contribute to the regeneration or enlargement of the pool of alveolar macrophages. In this study, we investigated the origin and proliferation of alveolar macrophages after lung transplantation in the rat.Orthotopic transplantation of the left lung was performed in the isogeneic LEW to LEW and in the allogeneic DA to LEW rat strain combination. To investigate the origin of alveolar macrophages by the detection of the y-chromosome, isogeneic and allogeneic transplantations were performed using female donors and male recipients.First, we determined the proportion of alveolar macrophages in pulmonary allografts expressing MHC class II antigens in double-staining experiments with ED1 and OX6. On day 3 and 4, about 25% of the alveolar macrophages expressed MHC class II. Subsequently, double-staining experiments using monoclonal antibodies ED1 and OX76 were performed. Approximately 10% of the alveolar macrophages on day 3 and 7% on day 4 expressed donor type MHC class II. We concluded that 40% of all alveolar macrophages on day 3 and 24% on day 4 were of donor origin. After sex-mismatched transplantations, we investigated the origin of the alveolar macrophages by detection of the y-chromosome by in situ hybridization and staining with monoclonal antibody ED1. We demonstrate that in lung allografts 56% of the alveolar macrophages are still of donor origin on day 4. After isogeneic transplantation 73% donor alveolar macrophages are detected.To label cell nuclei in the S-phase of the cell cycle, BrdU was injected on day 2 post transplantation 30 min before sacrificing the animals. Alveolar macrophages in the S-phase were detected using monoclonal antibodies ED1 and Bu20a, peribronchial and perivascular macrophages synthesizing DNA were identified with monoclonal antibodies ED2 and Bu20a. Whereas the incorporation of BrdU into the nuclei of alveolar macrophages in untreated control lungs was nearly 5%, on the second day after experimental lung transplantation, up to 21% of the alveolar macrophages displayed cell nuclei positive for BrdU, indicating that they synthesized DNA. No differences in the frequency of BrdU-positive macrophages were obvious between isografts and allografts. About 10% of the peribronchial and perivascular macrophages incorporated BrdU.We demonstrate that there is a lingering chimerism of alveolar macrophages in lung allografts. Furthermore we show that transplantation strongly induces proliferation of alveolar macrophages in the alveoli of the graft. This holds also true for peribronchial and perivascular macrophages, which proliferate but exhibit a slightly lower proliferative index. We are the first to describe high local proliferation rates of alveolar macrophages. Mitotic proliferation considerably contributes to the increase in the number of alveolar macrophages observed after isogeneic or allogeneic lung transplantation.