Wirkung des Akut-Phase-Proteins alpha-2-Makroglobulin auf die Vaskulogenese embryonaler Stammzellen der Maus

Abstract

alpha-2-Makroglobulin (a2M) ist ein Akut-Phase-Protein, welches bei Gewebsschädigung, z.B. bei Inflammation, Myokardinfarkt oder malignen Neoplasien, vermehrt im Blutplasma vorkommt. In dieser Arbeit wurde die Wirkung von a2M auf die Vaskulogenese in embryonalen Stammzellen (ES-Zellen) der Maus untersucht.Als Modell wurden embryoid bodies (EBs) verwendet, die aus ES-Zellen gezüchtet werden. Die Untersuchungen zur Proteinexpression und Proteinphosphorylierung wurden mit Hilfe immunhistochemischer Färbungen und Laserrastermikroskopie durchgeführt.Dabei konnte gezeigt werden, dass a2M die Vaskularisation der EBs stimuliert. Die Expression des Endothelzellmarkers CD31, wie auch die CD31-positiven Areale der EBs waren signifikant erhöht. In Folgeuntersuchungen wurde auch der Signaltransduktionsweg für diesen Effekt geklärt: eine Präinkubation mit einem Antikörper gegen den a2M-Rezeptor LRP-1 inhibierte die Wirkung von a2M, was auf eine Beteiligung dieses Rezeptors schließen lässt. Nach Inkubation von embryoid bodies mit a2M konnte die Aktivierung der ERK 1/2-Signalkaskade und der PI3-Kinase-Signalkaskade gezeigt werden. Weiterhin wurde die Aktivierung von eNOS und damit erhöhte p-eNOS Konzentration, wie auch eine erhöhte intrazelluläre NO-Generierung, nachgewiesen. Schließlich konnte auch eine vermehrte bFGF-Expression gezeigt werden.Die a2M-induzierte Vaskulogenese wurde jeweils gehemmt durch die Präinkubation mit PD98059, einem ERK 1/2-Inhibitor, mit LY294002, einem PI3-Kinase-Inhibitor, mit L-NAME, einem eNOS-Inhibitor und mit SU5402, einem Inhibitor des bFGF-Signalweges. Eine Auswirkung von a2M auf VEGF, HIF-1a und MAP p38 konnte dagegen nicht nachgewiesen werden. Eine vermehrte Expression von Ki67 in HUVEC konnte nicht gezeigt werden, was darauf hinweist, dass es sich bei der a2M-induzierten Vaskularisierung um den Effekt der Vaskulogenese handeln könnte.Diese Ergebnisse zeigen, dass a2M die Vaskulogenese in embryonalen Stammzellen der Maus über LRP-1, die Aktivierung von ERK 1/2, PI3-Kinase, eNOS, NO und schließlich über eine erhöhte Expression von bFGF induziert. Alpha-2 macroglobulin (a2M) is an acute phase protein increasingly released in reaction to tissue damage, e.g. inflammation, myocardial infarction or malignant neoplasms. In this study we investigated the effect of a2M on vasculogenesis in murine embryonic stem (ES) cells.We used Embryoid Bodies (EBs) as a model for vasculogenesis. EBs are grown from ES cells using a spinner flask system. We investigated protein expression and protein phosphorylation by using immunohistochemistry and confocal laser scanning microscopy. Nitric oxide (NO) generation was monitored by microfluorometry using the fluorescent NO indicator DAF-FM diacetate.a2M stimulates the vascularization of EBs. The expression of endothelial CD31, as well as CD31-positive areas of the EBs was significantly elevated. In follow-up studies on the signaling pathway for this effect we found that pre-incubation with an antibody to the a2M receptor LRP-1 inhibited the effect of a2M, which suggests an involvement of this receptor. After incubation of EBs with a2M activation of ERK 1/2 pathway and PI3 kinase pathway was shown. Furthermore, the activation of eNOS and therefore increased p-eNOS concentration were detected, as well as an increased intracellular NO generation and increased expression of bFGF.a2M induced vasculogenesis was inhibited after preincubation with different substances such as PD98059, an ERK 1/2-inhibitor, LY294002, a PI3-kinase inhibitor, L-NAME, an eNOS inhibitor or SU5402, an inhibitor of bFGF-signaling pathway. However, an effect of a2M on VEGF, HIF-1a and p38 MAPK could not be detected. Increased expression of Ki67 in HUVEC could not be shown, suggesting that a2M induced vascularization effect of cell differentiation rather than proliferation.These results show that a2M induces vasculogenesis in mouse embryonic stem cells via LRP-1, activation of ERK 1/2, PI3-kinase, eNOS, NO, and finally an increased expression of bFGF.