Untersuchungen zu Isoenzymen der Matrix-Metalloproteinasen MMP-2 und MMP-9 bei adulten Patienten mit cystischer Fibrose

Abstract

Die Familie der Matrix Metalloproteinasen (MMPs) ist in der Lage alle Komponenten der extrazellulären Matrix proteolytisch zu degradieren. MMPs spielen daher eine entscheidende Rolle für die Parenchymdestruktion in chronischen Lungenerkrankungen, inklusive der cystischen Fibrose. Eine Erhöhung der MMPs sowie ein Ungleichgewicht zu deren Inhibitoren, den Tissue Inhibitors of Metalloproteases (TIMP), steht in engem Zusammenhang zur Lungenfunktion und einer akuten pulmonalen Exazerbation. Mit Zunahme der Lebenserwartung erwachsener CF-Patienten kann die genaue Betrachtung des Proteasen-Antiproteasen-Verhältnisses sowie das Verhalten der MMP-9 Isoenzyme für die Langzeitprognose von grundlegender Bedeutung sein, da aktuell objektive Methoden zur Evaluierung des Krankheitsverlaufs und Therapieerfolgs fehlen.In dieser Arbeit wurden 136 Serumproben von 58 erwachsenen CF-Patienten sowie 40 Serumproben von 40 gesunden Kontrollpersonen mit Hilfe der Gelatinezymographie qualitativ und quantitativ auf die Anwesenheit von MMP-2 und MMP-9 untersucht. Schwerpunktmäßig wurden die gelatinolytische Aktivität der MMP-9 Isoenzyme, der aktiven und latenten Formen des MMP-9 Homodimers, des MMP-9/NGAL-Heterodimers sowie der aktiven und latenten Form des MMP-9 Monomers gemessen. Die Bestimmung erfolgte durch den Western Blot. Darüber hinaus wurden mittels ELISA Technik die Konzentrationen von MMP-2, MMP-8, MMP-9 und TIMP-1 bestimmt. Des Weiteren erfolgte eine klinische Unterteilung der Patientengruppe mit pulmonaler Exazerbation (PEx) nach dem Rosenfeld-Score. In neun Fällen erfolgte mittels der Werte aus Zymographie und ELISA eine Verlaufskontrolle vor und nach intravenöser antibiotischer Therapie.In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass die quantitative zymographische Bestimmung von aktivem und latentem MMP-9 sowie MMP-2 in einer hohen Korrelation zu den gewonnen ELISA Daten steht (r = 0,882). Für alle MMP-9 Isoenzyme und MMP-2 fanden sich erhöhte Enzymkonzentrationen im Vergleich zu der Kontrollgruppe, wobei eine deutliche Dominanz des aktiven MMP-9 Homodimers sowie des MMP-9/NGAL Heterodimers ersichtlich war. Von den 58 CF-Patienten wurde nach den klinischen Rosenfeld Kriterien bei 16 CF-Patienten eine akute pulmonale Exazerbation (PEx) diagnostiziert. Die Enzymkonzentrationen für MMP-2, MMP-8 und MMP-9 waren bei CF-Patienten mit PEx signifikant erhöht, verglichen mit CF-Patienten ohne PEx oder der gesunden Kontrollgruppe. MMP-2, MMP-8 und MMP-9 korrelierten zudem negativ mit den Lungenfunktionswerten, wie FEV1 und Vitalkapazität. Unter einer intravenösen antibiotischen Therapie bei CF-Patienten mit PEx konnte parallel zur Krankheitssymptomatik eine Abnahme von MMP-8 und MMP-9 beobachtet werden. TIMP-1 war in allen Proben (Kontrolle, CF-Patienten ohne PEx, CF-Patienten mit PEx) nachweisbar, die Konzentrationszunahme mit zunehmender Entzündungsreaktion fiel jedoch weniger stark aus als der Anstieg von MMP-9. Das Verhältnis von MMP-9 zu TIMP-1 stieg zwischen der Kontrollgruppe und CF-Patienten ohne PEx (p < 0,01) sowie zwischen CF-Patienten ohne PEx zu CF-Patienten mit PEX (p < 0,05) signifikant an. Es liegt also bei CF-Patienten ein Ungleichgewicht der Proteasen gegenüber ihren Inhibitoren vor. Zudem fand sich eine hohe Korrelation zwischen der MMP-8 und MMP-9 Konzentration (r = 0,856). Beide Isoenzyme korrelierten gleichzeitig signifikant mit den Leukozyten, insbesondere mit den neutrophilen Granulozyten.Die Ergebnisse betonen, dass erhöhte Serumkonzentrationen verschiedenster MMPs bereits bei klinisch asymptomatischen CF-Patienten erhöht sind, die Expression bei einer akuten pulmonalen Exazerbationen jedoch weiterhin stark zunimmt. Dabei steht nicht nur die MMP-9 Gesamtkonzentration in enger Korrelation zu den klinischen und laborchemischen Befunden, auch dem Verhältnis zu den natürlichen Inhibitoren sowie den aktivierten MMP-9 Isoenzymen kommt eine besondere Bedeutung zu. Hierin besteht ein diagnostischer Ansatzpunkt sowie eine Möglichkeit frühzeitig, also noch bevor sich dauerhafte Schäden eingestellt haben, eine zielgerichtete MMP-basierte medikamentöse Therapie bei CF-Patienten einzuleiten. Matrix metalloproteinases (MMPs), a family of proteolytic enzymes, degrade all components of the extracellular matrix and play a crucial role in the airway remodeling and tissue injury in cystic fibrosis (CF). An increased expression of various MMPs and the unbalance to their physiological inhibitors, the tissue inhibitors of metalloproteases (TIMP) is linked to impaired lung function and acute pulmonary exacerbation. Emanating from these previous findings, a quantitative analysis of the protease-antiprotease-balance and investigation of the MMP-9 variants might be fundamental for the health-related quality of life and probability of surviving of adult patients with CF. Currently objective methods to control the progress of the disease and therapeutic success are missing.In the study presented the qualitative and quantitative protease activity of MMP-2 and MMP-9 were investigated by deploying gelatin-zymography. A total of 136 blood serum samples of 58 adult CF patients compared to those of 40 healthy control individuals were analysed. Special attention was paid to the gelatinolytic activity of the MMP-9 variants, like active and inactive MMP-9 homodimer, MMP-9/NGAL heterodimer and active and inactive MMP-9 monomer. This enzyme classification was verified by Western Blot analysis. In addition, the concentrations of MMP-2, MMP-8, MMP-9, and TIMP-1 were also examined by ELISA. Furthermore CF patients with an acute pulmonary exacerbation (PEx) were identified based on the clinical score by Rosenfeld. In nine cases, the follow-up of zymography and ELISA were assessed before and after systemic antibiotic therapy.The results of the analysis showed a high correlation of active and inactive MMP-9 and MMP-2 between quantitative gelatin zymography and ELISA (r = 0,882). The increased serum gelatinolytic activity of all MMP-9 variants and MMP-2 in CF patient compared to the healthy control group was detected. Particularly active homodimer and MMP-9/NGAL heterodimer were raised. Among the 58 CF patients examinated, PEx was diagnosed for 16 of them. Serum levels of MMP-2, MMP-8 and MMP-9 were significantly elevated in CF patients with PEx, compared to CF patients without PEx and healthy controls. These data also show that the increase of MMP-2, MMP-8 and MMP-9 is associated with a decrease of pulmonary function, as measured by forced expiratory volume in 1 sec (FEV1) (p < 0,01) and vital capacity (p < 0,01).Antibiotic treatment of CF patients with PEx led to a decrease of MMP-8 and MMP-9 protein concentrations, which correlate with other clinical parameters. In all samples, TIMP-1 was detectable. However, TIMP-1 concentration did increase less than the inflammatory response of MMP-9. The MMP-9/TIMP-1 molar ratio was significantly higher in the CF group without PEx than in the control group (p < 0,01) and also higher in the CF group with PEx than in the CF group without PEx (p < 0,05). Hence, an imbalance between the protease and their inhibitors exists. In addition, MMP-8 and MMP-9 concentrations correlated with each other (r = 0,856) and moreover were positively correlated with the total white cells count, especially the neutrophil granulocytes.The data of this study provide with compelling evidence the increased serum concentration of certain MMPs found for patients with clinically stable CF lung disease, which again rise in the case of pulmonary exacerbation. It is not only the MMP-9 concentration as a whole associated with other clinical and laboratory findings, but also its interaction with TIMP-1 and the active MMP-9 variants, particularly the active homodimer, that seem to be important. These relations may be useful surrogate markers and could furthermore lead to the development of specific MMP-based medical treatment to prevent chronic airway remodeling and tissue destruction for patients with CF.