Natural tissue engineering : Plastizität zirkulierender Stammzellen im gesunden kardialen Milieu

Abstract

Trotz aller Bemühungen ist bis heute keine kurative Therapie des abgelaufenen Myokardinfarktes verfügbar. Verschiedene Studien haben darauf hingedeutet, dass die Injektion von Stammzellen das klinische Outcome verbessern kann. Dieses wird jedoch nicht von allen Studien bestätigt, weshalb das Benefit einer Stammzelltherapie kontrovers diskutiert wird.Ursächlich für die positiven Beobachtungen scheinen jedoch nicht Stammzell-differenzierungen sondern viel mehr parakrine Effekte der transplantierten Zellen zu sein. So zeigten diese in-vivo-Studien wider Erwarten keine Wiederherstellung des Myokards, obwohl in vitro Stammzellen offenbar in Kardiomyozyten differenzieren können.Um grundlegend zu klären, in welchem Ausmaß zirkulierende Stammzellen in vivo in der kardialen Umgebung differenzieren können, wenn sie keinem pathologischen Milieu ausgesetzt sind, wurde ein Schweinemodell entwickelt. In diesem Modell wurden Membranen im linken Ventrikel und als Kontrolle in der Aorta abdominalis über ein perkutanes Vorgehen implantiert. Aufgrund der speziell konstruierten Membranaufhängung flottierten die Membranen frei im Blutfluss, ohne dabei Kontakt zu den umgebenden Geweben zu bekommen. So konnten lediglich im Blut zirkulierende Zellen auf die Membranen migrieren. Die Membranen wurden nach drei Tagen, zwei, sechs und zwölf Wochen (n=8 Schweine) entnommen und umfassend mittels Real-Time-PCR, Immunhistochemie, Elektronenmikroskopie und In-situ-Hybridisierung untersucht. Einer weiteren Gruppe wurde GM-CSF (10µg/kg KG für sieben Tage, n=8 Schweine) appliziert und die Membranen nach sechs Wochen entnommen.In den ersten drei Tagen zeigten sich primär Entzündungszellen auf den Membranen. Zeitabhängig kam es zur Zunahme des Gewebedurchmessers, zur Ausbildung einer dichten Innenschicht aSMApositiver Zellen und einer Vimentinpositiven Außenschicht. Zum Lumen hin abgeschlossen wurde das Gewebe von einem vWFpositiven Monolayer. Durch CD146-Färbungen und Elektronenmikroskopie ließ sich ein ausgeprägtes Kapillarnetzwerk nachweisen. Auf den Membranen konnten Stammzellmarker der hämatopoetischen (CD34 / c-kit) und der mesenchymalen Stammzellreihe (CD44 / Vimentin), sowie von endothelialen Progenitorzellen (CD133 / 146) nachgewiesen werden. Durch die Applikation von GM-CSF konnte eine signifikante Zunahme der Zellproliferation, Stammzellmarkerexpression und Marker früher Kardiomyozyten (GATA4 isoliert im linken Ventrikel) erreicht werden.Die Ergebnisse zeigen, dass adulte zirkulierende Schweinestammzellen in vivo fähig sind, in kardialer Umgebung vielfältig zu differenzieren und dabei ein fein kapillarisiertes spezialisiertes Gewebe ausbilden. Dieser stammzellvermittelte Prozess ließ sich durch die Injektion von GM-CSF weiter steigern. Die hier erstmals im gesunden Organismus nachgewiesene umfangreiche Stammzellplastizität innerhalb kardialer / vaskulärer Umgebungsnischen spricht daher eindeutig für die Erfolgswahrscheinlichkeit einer Weiterentwicklung regenerativer Therapieansätze durch Stammzellmobilisation und Tissue Engineering. It is widely known, that circulating stem cells take part in the physiological development after myocardial infarction. In clinical trials differentiation capacity of stem cells were widely used to enhance myocardial infarct therapy. But only little effects were achived which were mainly explained by cell fusion of arrived stem cells with present, adult myocardial cells or paracrine effects. Cardiomyocytes derived by stem cell differentiation were not observed although in vitro experiences showed their cardiomyocyte potential. We suspected the ischemic-necrotic infarct milieu to prevent a more distinct differentiation of circulating stem cells. The aim of the present study was to evaluate this hypothesis and to investigate the physiological differentiation and transdifferentiation potential of circulating stem cells in the healthy cardiac environment. Therefore, we developed an animal model using pigs in which a freely floating membrane was inserted into the left ventricle and the descending aorta by a catheter approach. Membranes were removed after 3 days and 2, 6 and 12 weeks. Another group of pigs was treated with granulocyte macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF; 10µg/kg KG BW) early after implantation. Membranes were removed after 6 weeks. The explanted membranes were evaluated using quantitative RT-PCR, immunohistochemistry and in situ hybridization. Typical markers of hematopoetic stem cells (HSC; CD34 / c-kit) and mesenchymal stem cells (MSC; CD44 / Vimentin) were detected. We demonstrated a time-dependent generation of a fully differentiated tissue composed of fibroblasts, myofibroblasts, smooth muscle cells, endothelial cells and new blood vessels derived by differention of homing stem cells. Stem cell mobilization with GM-CSF led to more rapid tissue growth and differentiation. In conclusion circulating stem cells contributed to the development of a fully differentiated tissue on membranes placed within the left ventricle or descending aorta under physiological conditions.