Sphingosinkinase-1 im Signaltransduktionsweg muskarinischer Rezeptoren in den peripheren Atemwegen der Maus

Abstract

In peripheren Atemwegen erfolgt eine Konstriktion als Antwort auf eine Freisetzung von Acetylcholin (ACh) aus den parasympathischen Nervenfasern. Stimulation muskarinischer Rezeptoren (mAChR) führt in den bronchialen glatten Muskelzellen zu einem intrazellulären Anstieg von Kalzium (Ca2+). Die Reaktion auf ACh ist bei Lungenerkrankungen wie Asthma bronchiale erhöht. Ein Modulator des intrazellulären Kalziumspiegels ist Sphingosin 1-Phosphat (S1P), welches durch die Sphingosinkinase-1 und 2 (SPHK1 u. 2) gebildet wird. Es ist bekannt als wichtiger Botenstoff bei vielen biologischen Reaktionsketten, z.B. Überleben von Zellen und Neubildung von Gefäßen. Unsere Hypothese war, dass S1P in der intrazellulären Signalkaskade nach Stimulation mAChR in den peripheren Atemwegen eingebunden ist. Mit Hilfe der Videomorphometrie erfolgte an vitalen Lungenschnitten von Mäusen unter einem invertierten Mikroskop die digitale Aufzeichnung der Bronchioli, wobei die Veränderung der luminalen Fläche von Bronchioli in Reaktion auf die pharmakologische Intervention ermittelt wurde. Nach Stimulation mAChR mit Muskarin konnte eine Konstriktion der broncholuminalen Fläche um 50 % bis 60 % dokumentiert werden. Die Inhibierung der SPHK1 mittels DL-Threo-Dihydrosphingosin (DHS) und N,N-Dimethylsphingosin (DMS) führte zu einer signifikant abgeschwächten durch mAChR vermittelten Bronchokonstriktion, wobei der bronchokonstriktorische Effekt von U46619 (Thromboxan-Analogon) durch DHS/DMS nicht beeinflusst wurde. Bei gemeinsamer Applikation von Muskarin und Lanthan (Inhibitor von spannungsabhängigen Kalziumkanälen und TRPC-Kanälen) war die Initialkonstriktion und die anhaltende Kontriktion signifikant abgeschwächt im Vergleich zu alleiniger Muskarinapplikation. Die Applikation von Lanthan und DHS/DMS blockierte die broncholuminale Konstriktion auf Muskaringabe vollständig. Die Experimente demonstrieren zum ersten Mal die Aktivierung von Sphingosinkinasen in der Signalkaskade der muskarinischen Bronchokonstriktion in den peripheren Atemwegen der Maus. Vor dem Hintergrund der bedeutenden Rolle, die mAChR bei Lungenerkrankungen spielen, könnten die hier gefundenen Ergebnisse in der Zukunft Einfluss auf die medikamentöse Therapie erlangen. Peripheral airways constrict in response to acetylcholine (ACh) released from parasympathetic nerve fibres leading to the increase in intracellular calcium (Ca2+) in response to the activation of muscarinic acetylcholine receptors (mAChR). During airway diseases such as asthma, peripheral airways are hyperactive and show an increased response to mAChR stimulation. Many studies have shown sphingosine-1 phosphate (S1P) as an important mediator for intracellular calcium. S1P is well known as an important extracellular mediator of a magnitude of biological pathways, e.g. cell survival and angiogenesis. The sphingosine kinases (SPHK1 and 2) catalyse the formation of S1P. We tested the hypothesis that the generation of S1P is integrated in the mAChR signalling of peripheral airways.Videomorphometric analysis was performed using precision cut lung slices to study bronco-luminal behaviour on those vital lung slices. Under an inverted microscope digital pictures of the bronchioli were taken to determine changes in the area of the airway lumen in response to pharmacological stimulation. Stimulation of mAChR with muscarine led to a constriction of peripheral airways of 50 % to 60 %. Blockade of SPHK1 activity through the Inhibitors of sphingosine kinase DL-threo-Dihydrosphingosine (DHS) and N,N-Dimethylsphingosine (DMS) led to a significant reduction of mAChR mediated airway constriction whereas the bronchoconstrictory effect of the thromboxan analogon U46619 was not influenced by SPHK1 inhibition. The DHS/DMS mediated inhibition reduced mainly the initial phase of constriction. This strongly suggests the subsequent activation of SPHKs in response to specific stimulation of mAChR.Application of muscarine in combination with the voltage gated calcium channel and TRP channel blocker lanthanium chloride abolished the prolonged constriction in response to mAChR stimulation. Application of DHS/DMS together with lanthanium chloride abolished the mAChR mediated constriction of peripheral airways.The experiments demonstrate for the first time the specific coupling of muscarinic ACh receptors to the stimulation of sphingosine kinases in murine peripheral airways. Given the important role of muscarinic cholinergic mechanisms in pulmonary disease, these findings should be of considerable therapeutic relevance.