Trpv4-abhängige Regulation der endothelialen Genexpression in einem nichtlaminaren Strömungsmodell sowie der neointimalen Proliferation nach Stentimplantation

Abstract

In dem vorliegenden Projekt wurde die Expression der Gene Trpv4, NFATc1, Calcineurin, MEF2c, c-jun, c-fos, CREB1, CREB2, ICAM-1 und VCAM-1 in Abhängigkeit von nichtlaminarer Strömung untersucht. Diese steht im Gegensatz zur laminaren Strömung und wird im Zusammenhang mit pathologischen Prozessen des Gefäßsystems, wie der Instent-Restenose oder Arteriosklerose, diskutiert.Die Erzeugung nichtlaminarer Schubspannung in vitro erfolgte durch Einsatz eines Strömungsmodells, in welchem porcine Aortenendothelzellen für 3, 18 und 48 Stunden zyklischen Bewegungen des Kulturmediums ausgesetzt wurden. Um einen Zusammenhang zwischen Trpv4-Aktivierung und der Expression genannter Gene zu ermitteln, wurde das Experiment unter Trpv4-Inhibition mittels Ruthenium Rot wiederholt. In vivo wurden unbeschichtete Stents in porcine Koronararterien implantiert. Die Genexpression wurde mittels quantitativer Real-Time-PCR analysiert. Außerdem erfolgte im Bereich der gestenteten Koronararterien eine immunhistochemische Markierung der Proteine Trpv4, NFATc1 und pNFATc1 sowie CREB1. Des Weiteren wurde in einem porcinen Großtierprojekt die koronare Instent-Restenose nach Gabe von 4alphaPDD, einem Trpv4-Aktivator, im Vergleich zur unbehandelten Kontrolle ermittelt. Die endotheliale Expression aller untersuchten Gene zeigte sich durch die erzeugte nichtlaminare Strömung in vitro beeinflussbar. Allerdings ließ sich die Verbindung zum Trpv4-Kanal aufgrund der bereits unter statischen Bedingungen festgestellten Expressionsunterschiede nicht mit Sicherheit nachweisen. Die Gentranskription von NFATc1, ICAM-1, VCAM-1 und c-jun war unter Einsatz von Ruthenium Rot vermindert. Bei Trpv4 und MEF2c war im Vergleich zur behandelten Gruppe die Expression in der unbehandelten Gruppe dagegen reduziert. Die übrigen Gene (c-fos, calcineurin, CREB1 und CREB2) wiesen ein unregelmäßiges Expressionsmuster auf.In der Analyse der Genexpression in gestenteten Koronararterien konnte für Trpv4, NFATc1, Calcineurin, CREB2, c-fos und ICAM-1 im Vergleich zur ungestenteten Kontrollkoronararterie eine erhöhte Transkription ermittelt werden, im Gegensatz zu MEF2C und CREB1, die keine Veränderung der Expression aufwiesen sowie zu c-jun, das sogar eine vorübergehende Downregulation zeigte.In der histomorphometrischen Analyse gestenteter Koronararterien zeigte sich nach Behandlung mit 4alphaPDD eine Steigerung der Instent-Restenose von 20 % im Vergleich zur Kontrolle. Dieses Ergebnis legt nahe, dass neben inflammatorischen Prozessen auch eine Trpv4-Aktivierung an der Proliferation und Migration von glatten Muskelzellen im Rahmen eines neointimalen Wachstums beteiligt sein könnte. Aufgrund der Ergebnisse der vorliegenden Arbeit kann man schlussfolgern, dass nichtlaminare Strömung sowohl in vitro als auch in vivo Einfluss auf die endotheliale Gentranskription ausübt. Im Vergleich mit anderen Publikationen wurde die These, dass nichtlaminare und laminare Strömungen unterschiedliche biologische Folgen haben und insbesondere erstere für klinisch relevante pathologische Prozesse verantwortlich sind, bestärkt. Das Transkriptionsprofil von NFATc1, c-jun, ICAM-1 und VCAM-1 deutet auf einen Trpv4-bedingten Kalziumeinstrom in vitro hin. Aufgrund der Tatsache, dass Trpv4 verstärkend im Rahmen der Neointimaproliferation wirkt, ist eine Behandlung nach Stentimplantation mit chemischen Inhibitoren von Trpv4 als eine weitere Möglichkeit zur Reduzierung der Instent-Restenose denkbar. This project investigated the expression of the genes Trpv4, NFATc1, calcineurin, MEF2C, c-jun, c-fos, CREB1, CREB2, ICAM-1 and VCAM-1, depending on a non-laminar flow. Non-laminar flow is in contrast to laminar flow, and is discussed to be related to pathological processes of the vasculature, such as atherosclerosis and in-stent restenosis.Non-laminar shear stress in vitro was successfully established by a flow model of porcine aortic endothelial cells, being exposed to cyclical movements of media for 3, 18 and 48 hours. To confirm a relationship between Trpv4-activation and the expression of its downstream targets (listed above), the experiment was repeated under Trpv4- inhibition by ruthenium red. In vivo bare metal stents were implanted in porcine coronary arteries. Gene expression was analyzed by quantitative real-time PCR. Additionally, immunohistochemical analysis including staining for the proteins Trpv4, NFATc1, pNFATc1 and CREB1 was done in the region of stented coronary arteries. Furthermore, in a porcine model of stenting, the coronary in-stent restenosis was determined after application of 4alphaPDD, a Trpv4-activator, in comparison to the untreated control.The endothelial gene expression was shown to be influenced by non-laminar flow in vitro. However, a relation to the Trpv4 channel could not be verified definitely, due to differences in expression ascertained under static conditions. The gene transcription of NFATc1, ICAM-1, VCAM-1 and c-jun was reduced with the use of ruthenium red. In contrast, compared the expression of Trpv4 and MEF2c was reduced in the control group compared with the treated group. The remaining genes (CREB1, CREB2, calcineurin, c-fos) showed an irregular pattern of expression.In stented coronary arteries Trpv4, NFATc1, calcineurin, CREB2, c-fos and ICAM-1 showed an increased expression compared to the unstented controls. In contrast, for MEF2C and CREB1 no difference in expression could be demonstrated. C-jun showed a transient downregulation. In the histomorphometric analysis of stented coronary arteries a 20% rise of in-stent restosis was shown after treatment with 4alphaPDD in comparison to the untreated control.These results suggest that a Trpv4-activation is involved in the proliferation and migration of smooth muscle cells regarding the neointimal growth after stenting. Based on the results of this study it can be conclude that non-laminar flow has an influence on the endothelial gene transcription of both in vitro and in vivo.The thesis, that non-laminar and laminar flow have different biological effects and especially non-laminar flow is responsible for clinically relevant pathological processes, could be reinforced. In vitro the gene transcription profile of NFAT, c-jun, ICAM-1 and VCAM-1 points to a Trpv4-dependent calcium-signalling in presence of non-laminar flow. The treatment with chemical Trpv4 -inhibitors after coronary stent implantation might be a valuable option to reduce the rate of instent restenosis.