Die Bedeutung von mechanischem Stress für die Vaskulogenese embryonaler Stammzellen und die Expression von Axon-Guidance Molekülen

Abstract

Bereits in der frühesten Phase der Embryogenese nehmen physikalische Kräfte Einfluss auf die unterschiedlichsten physiologischen Prozesse. Daher sollte in dieser Arbeit die Bedeutung von mechanischen Kräften für die Vaskulogenese eingehender untersucht werden. Dazu wurde hier das EB-Modell verwendet. Dieses in vitro Modell eignet sich auf Grund seiner Eigenschaften (Zell-Zell und Zell-Matrix Interaktion) besonders für die Untersuchung angiogener Prozesse. Die Daten der vorliegenden Studie zeigen, dass die Applikation von mechanischen Zugkräften zu einem Anstieg der Vaskularisierung der EBs führt. Von besonderer Bedeutung ist dabei der unmittelbar auf die Dehnung folgende Anstieg der intrazellulären Kalziumkonzentration. Durch die Zugabe des Chelators BAPTA-AM konnte dieser Anstieg gehemmt und der Effekt der Dehnung auf die Vaskularisierung aufgehoben werden. In den weiteren Untersuchungen konnte zudem ein positiver Einfluss der mechanischen Zugbelastung auf die für die Gefäßbildung förderlichen Faktoren (Axon-Guidance Proteine, Wachstumsfaktoren, ROS, NO, MAPKs und PI3K) nachgewiesen und zum Teil ein Zusammenhang mit dem Anstieg der intrazellulären Kalziumkonzentration aufgezeigt werden. Die Stressapplikation hatte einen Anstieg der Expression von Proteinen zur Folge, die zur charakteristischen Signatur von Tip- und Stalk-Zellen zählen. So konnte ein Anstieg der Expression von Neuropilin1, PDGF-BB und VEGF-R2 sowie Robo4 und FGF2 gezeigt werden. Die Chelatierung des intrazellulären Kalziums während der Dehnung hatte zur Folge, dass die Zunahme der Expression von Neuropilin1, PDGF-BB und FGF2 ausblieb. Die Bedeutung des VEGF-R2 für die Vaskularisierung in Folge der Zugbelastung konnte zusätzlich durch dessen Inhibierung mit SU5614 dargestellt werden Zudem legt das Expressionsverhalten einiger Proteine einen förderlichen Einfluss der Dehnung auf die Bildung von arteriellem Endothel nahe. So stieg durch die mechanische Zugbelastung die Expression des arteriellen Marker EphrinB2 an, während die des venösen Markers EphB4 signifikant zurückging. Im Zuge der Dehnung der EBs war ein zeitnaher Anstieg der ROS Bildung festzustellen. Die Generierung der ROS konnte durch eine Behandlung der EBs mit dem NADPH-Oxidase spezifischen Inhibitor VAS2870 aufgehoben werden. Dies ermöglichte es, die NADPH-Oxidase als Quelle der stressinduzierten ROS zu identifizierten. Zudem ergab sich ein Zusammenhang zwischen den durch die Dehnung gebildeten ROS und dem intrazellulären Kalzium, da eine Vorinkubation der EBs mit BAPTA-AM die durch die Zugbelastung induzierte ROS Synthese unterdrückte. Die Stressapplikation führte außerdem zu einem Anstieg der NO Bildung in den EBs. Als Quelle konnte hier die eNOS ausgemacht werden, da diese nach 30 min Zugbelastung signifikant phosphoryliert vorlag. Durch die Chelatierung des intrazellulären Kalziums kam es zu einem Rückgang der Phosphorylierung der eNOS und der NO Generierung, was die Beteiligung der CaMK II an der eNOS Phosphorylierung nahelegt.Die Zugbelastung hatte zudem eine Zunahme der Aktivität der MAPK (ERK und JNK) sowie der PI3K zur Folge. Der Anstieg der PI3K Aktivität im Zuge der mechanischen Dehnung konnte durch die Behandlung der EBs mit dem Inhibitor LY-294002 aufgehoben werden. Dies zeigt, dass die als Teil eines mechanosensorischen Komplexes wirkende PI3K für die Transduktion der mechanischen Reize die auf die EBs ausgeübt wurden von Bedeutung ist. Physical forces are able to influence physiological processes within in the earliest stages of embryogenesis. Thus the aim of this work was to analyse the meaning of mechanical forces for the vasculogenesis of embryonic stem cells. Therefore we used the in vitro EB-Model, because based on its properties (cell-cell and cell-matrix interaction) this model offers the opportunity to investigate angiogenic processes. In the present study it is shown that the application of mechanical forces leads to an increased vascularisation of EBs. Of special significance in this process is the instantaneous increase of the intracellular calcium concentration following the stretching of EBs. By treating the cells with the calcium Chelator BAPTA-AM this increase was stunted causing the abolishment of the observed effect of strain towards vascularisation.It was observed that the application of mechanical strain had a positive impact on elements (axon-guidance proteins, growth factors, ROS, NO, MAPKs, PI3K) causative for the vessel formation in EBs. Furthermore we were able to show that this positive impact was in part related to the increase of intracellular calcium concentration. As a result of the application of mechanical forces the expression of proteins belonging to the characteristic molecular signature of Tip and Stalk cells were increased. Gain in expression was observed for Neuropilin1, PDGF-BB and VEGF-R2 as well as Robo4 and FGF2. Chelating the intracellular calcium during stretch abolished this gain in expression for Neuropilin1, PDGF-BB and FGF2. The meaning of VEGF-R2 for the strain-induced vasculogenesis was illustrated by its inhibition with SU5614, which caused an anti-angiogenic effect. Because of the expression pattern of some of the analysed proteins it is reasonable that stretch has a beneficial influence of the formation of arterial endothelium. Mechanical strain caused a significant increase of the expression of the arterial marker EphrinB2 while there was a significant decrease of the venous marker EphB4. Following of strain application we were able to observe an increase of ROS production. The ROS generation was abolished upon treatment with the NADPH-oxidase-specific inhibitor VAS2870. Presumably the NADPH-oxidase was the source of the strain-induced ROS production in EBs. Moreover we were able to show a connection between -induced ROS production and intracellular calcium. Pre-incubation of EBs with the Chelator BAPTA-AM caused a suppression of the ROS formation evoked by mechanical forces.Furthermore the strain application caused an increase of the NO production in EBs. The source of the NO formation was supposed to be the eNOS, since we observed a significant increase in phosphorylation 30 min after the strain. The eNOS phosphorylation and the NO generation were significantly decreased when EBs were pre-incubated with BAPTA-AM. This suggests an involvement of CaMK II in the phosphoryliation of eNOS. Mechanical strain application also leads to an increased activity of MAPKs (ERK/JNK) and PI3K. The gain in activity of the PI3K due to the mechanical strain was abolished after the treatment with the inhibitor LY-294002. Therefore it is reasonable that the activity of the PI3K, which is part of a mechanosensoring complex, is important for transduction of mechanical signals imposed on EBs during strain application.