Knochenmarktransplantation führt zu fibrosierender cholestatischer Hepatitis im Mausmodell der viralen Hepatitis B

Abstract

Weltweit leiden etwa 300 Millionen Menschen an einer chronischen Hepatitis B Infektion. Das Hepatitis B Virus (HBV) gehört damit zu den häufigsten Infektionskrankheiten. Das Endstadium der Erkrankung ist die Entwicklung einer hepatischen Zirrhose und eines hepatozellulären Karzinoms. Für beide Krankheitsbilder stellt HBV weltweit die häufigste Ursache dar. Die Behandlungsoptionen einer Leberzirrhose, wie z.B. die aufwendige und potentiell komplikationsreiche Lebertransplantation, sind nach wie vor (auch aufgrund fehlender Spenderorgane) sehr limitiert. Hoffnung machen neue Erkenntnisse auf dem Gebiet der Stammzellforschung bzw. Knochenmarktransplantation (KMT). Durch Transplantation gesunder multipotenter Stammzellen kann eine bereits fortgeschritten fibrotische Leber in ihrer Funktion und histologischen Architektur positiv beeinflusst werden.In dieser Arbeit wurde der Einfluss einer syngenen KMT auf die hepatische Fibrose in einem HBV-transgenen Mausmodell (Tg) untersucht. Dazu wurden aus gesunden GFP-exprimierenden Mäusen KM-Zellen isoliert und in die Schwanzvenen der zuvor tödlich bestrahlten 12 Wochen alten HBV-transgenen Mäuse transplantiert (Tg-Tx). Als Kontrollgruppe dienten jeweils gesunde nicht-transplantierte (Lm) sowie transplantierte Wildtyp-Mäuse (Lm-Tx). Die Mäuse wurden im Alter von 26 sowie 52 Wochen getötet und untersucht.Die allgemeine hepatische Funktion sowie das Ausmaß der Leberfibrose wurden anhand der Serumparameter Alanin-Aminotransferase (ALT) und alkalische Phosphatase (AP), der Quantifizierung des hepatischen Hydroxyprolin-Gehalts sowie dem Nachweis verschiedener Fibrose-assoziierter Gene mittels q-PCR (col1a1, MMPs, TIMP etc.) erfasst. Die Histologie bzw. Immunhistochemie stellte bei der Charakterisierung der hepatischen Schädigung eine zentrale Methode dar. Die Untersuchungen beinhalteten histologische Analysen mittels H&E-Färbung, Fibrose-spezifische Anwendungen wie die Sirius-Rot-Färbung, Nachweis von Desmin-positiven hepatischen Sternzellen (HSC), HBsAg-positiven Hepatozyten, A6-exprimierenden Ovalzellen etc. Das Gelingen der KMT wurde durch den immunhistologischen Nachweis von GFP überprüft. Die histologische Erfassung von p21, p27 und des Seneszenz-assoziierten Beta-Galaktosidase (SABG)-Assays dienten dazu den Status des Zellzyklus zu untersuchen. Zusätzlich wurde eine Microarray-Genexpressionsanalyse des kompletten Mäusegenoms durchgeführt. Die Ergebnisse wurden anschließend mit einem gut etabliertem Modell der sklerosierenden Cholangitis, der Abcb4-Knockout-Maus (Abcb4-/-), verglichen.Überraschenderweise zeigte sich, dass die KMT in HBV-transgenen Mäusen zu einer Aggravierung der hepatischen Fibrose führte. Tg-Tx demonstrierten gegenüber Lm, Lm-Tx sowie Tg signifikant gestiegene ALT-Werte, ein verschlechtertes Grading und Staging nach Desmet in H&E- und Sirius-Rot-Färbung sowie eine erhöhte Expression von Desmin im Sinne einer vermehrten Aktivierung von HSCs. In der Sirius-Rot-Färbung registrierten wir eine generell gestiegene Kollagendeposition, zusätzlich war diese besonders periportal lokalisiert. Darüber hinaus wurde eine signifikante Cholestase in Tg-Tx apparent. Die Hochregulation von profibrotischen bzw. proinflammatorischen Genen wie TIMP-1, MMPs, TGF-ß, Cola1a unterstützte den Befund der aggra-vierten hepatischen Fibrose. Tg-Tx-Mäuse demonstrierten, aufgrund einer Einschränkung der Regenerationsfähigkeit, einen erhöhten Anteil seneszenter, sich im arretierten Zellzyklus befindlicher Hepatozyten. Da die seneszenten Hepatozyten insbesondere portal lokalisiert waren, schlossen wir auf eine mögliche duktuläre Reaktion (Proliferation von hepatischen Progenitorzellen in der portalen Zone). Mithilfe des immunhistochemischen Nachweises hepatischer Progenitorzellen anhand von CK7, CK19, Sox9 und A6 konnten wir in Tg-Tx eine ausgeprägte duktuläre Reaktion nachweisen.Ein Micro-Array-Vergleich der Genregulation von Tg-Tx mit Abcb4-/--Mäusen, offenbarte eine erstaunliche Übereinstimmung der Expression bestimmter Gene (proinflammatorisch, profibrinogen, prokanzerogen). Die Microarray-Ergebnisse suggerierten einen ähnlichen Pathomechanismus beider Mausmodelle. Bei der anschließenden Analyse und Recherche rückte die fulminant verlaufende, unter Immunsuppression wiederkehrende infektiöse Hepatitis, die sog. fibrosierende cholestatische Hepatitis (FCH) in unseren Fokus. Tg-Tx-Mäuse wiesen wesentliche Merkmale einer FCH, wie hepatische Inflammation, milde bis stark ausgeprägte periportale Fibrose, Schwellung der Hepatozyten, Cholestase sowie eine duktuläre Reaktion auf.Die Folge einer KMT in HBV-transgenen Mäusen ist demnach die Entwicklung einer FCH. Wir haben somit erstmals ein murines Modell entwickelt welches das Krankheitsbild der FCH weitgehend simuliert. An unserem Modell können nun molekularpathologische und zelluläre Mechanismen sowie Therapieansätze der FCH untersucht werden. Worldwide about 300 million people suffer from chronic hepatitis B infection. The Hepatitis B virus (HBV) is therefore one of the most common infectious diseases. The end stage of the disease is the development of hepatic cirrhosis and hepatocellular carcinoma. HBV is the most common cause for both diseases. Treatment options of liver cirrhosis, such as the complicated and possibly dangerous liver transplantation are still (also because of missing donor organs) very limited. New developments in the field of stem cell research or bone marrow transplantation (BMT) give new hope. A fibrotically advanced liver can be positively influenced in its function and histological architecture via the transplantation of healthy multipotent stem cells.In this study we examined the influence of syngenic BMT on hepatic fibrosis in a HBV-transgenic mouse model (Tg). BM-cells from healthy GFP-expressing donor mice were isolated and injected in the tail veins of lethally irradiated 12 week old HBV-transgenic mice (Tg-Tx). Healthy non-transplanted littermates (Lm) and transplanted-littermates (Lm-Tx) served as controls. The mice were sacrificed and analyzed at the age of 26 and 52 weeks. Overall hepatic function and the extent of liver fibrosis was assessed using serum parameters alanine aminotransferase (ALT), alkaline phosphatase (AP), quantification of hepatic hydroxyproline content and detection of various fibrosis related genes in q-PCR (col1a1, MMPs, TIMP etc.). Histology and immunohistochemistry played important roles in the characterization of hepatic injury. Investigations were conducted via histological analysis in H&E staining, fibrosis-specific applications such as the Sirius-red staining, detection of desmin positive hepatic stellate cells (HSC), HBsAg positive hepatocytes, A6 expressing oval cells etc. Success of BMT was verified by immunohistochemical staining of GFP. Cell cycle state was investigated by his-tological detection of p21, p27 and the senescence-associated beta-galactosidase (SABG)-assay. Additionally we conducted a micro-array gene expression analysis of the whole mouse genome. The results were then compared with a well-established mouse model of sclerosing cholangitis, the Abcb4-knockout-mouse (Abcb4-/-).Surprisingly BMT in HBV-transgenic mice led to an aggravation of hepatic fibrosis. Tg-Tx demonstrated significant ALT elevation compared to Lm, Lm-Tx and Tg, deteriorated grading and staging in histological analysis in H&E- and Sirius-red staining plus a heightened expression of desmin, demonstrating activation of HSCs. Sirius-red staining revealed a general increase in collagen deposition. Additionally collagen was localized preferably in the periportal region. Moreover we could observe a significant cholestasis in Tg-Tx. Upregulation of pro-fibrotic and pro-inflammatory genes such as TIMP-1, MMPs, TGF-ß, and Cola1a in q-PCR supported the aggravated hepatic fibrosis. Impairment of regeneration led to increased numbers of senescent hepatocytes in Tg-Tx mice. The senescent hepatocytes were found specifically in the periportal region, this implied the existence of a ductular reaction (proliferation of hepatic progenitor cells in the portal region). Immunohistochemical findings of CK7, CK19, Sox9 and verified a marked ductular reaction in Tg-Tx.Comparison of gene regulation in Tg-Tx and Abcb4-/- via micro-array revealed an astonishing similarity in the expression of selected genes (pro-inflammatory, pro-fibrotic and pro-oncogenic). Micro-array results suggested a similar pathomechanism of both mouse models. In the following analysis and investigation fibrosing cholestatic hepatitis (FCH) moved in to our focus. FCH is a fulminant form of recurring infectious hepatitis under immunosuppression. Tg-Tx mice displayed essential characteristics of FCH, like hepatic inflammation, mild to marked periportal fibrosis, feathery degeneration of hepatocytes, cholestasis and ductular reaction.Therefore BMT in HBV-transgenic mice leads to the development of FCH. We have for the first time developed a murine model, which simulates the disease pattern of FCH to a large extent. With our model it is now possible to investigate molecular pathological and cellular mechanism as well as new therapeutic approaches of FCH.