Evaluierung von Methoden zur in situ Charakterisierung der Polysialylierung des neuralen Zelladhäsionsmoleküls NCAM

Abstract

Die posttranslationale Polysialylierung des neuralen Zelladhäsionsmoleküls NCAM spielt eine wichtige Rolle während der neonatalen Hirnentwicklung, bei funktionellen Prozessen des Nervensystems und Regeneration von neuronalen Strukturen.Im Rahmen dieser Arbeit evaluierten wir Methoden zur in situ Charakterisierung der Polysialylierung des neuralen Zelladhäsionsmoleküls NCAM. Bedingt durch die große Verfügbarkeit an meist formalinfixiertem Material war es von Interesse, die Analysemethoden zur Detektion von PolySia zu adaptieren, da diese bisher nur an frisch gewonnenem Material eingesetzt wurden. Erste Untersuchungen stellten die Auswirkung der Konservierung mittels Formalin auf den Nachweis des Polysialylierungsgrades des Gewebes mittels chromatographischer Methoden dar. Durch diverse präanalytische Aufreinigungsschritte gelang es schließlich, die von Inaktivierung des Fluoreszenzfarbstoffs herrührenden Artefakte zu eliminieren, mit typischer Peak-Verteilung. Die letztlich reproduzierbaren Chromatogramme mit der Möglichkeit der Kettenlängenbestimmung stimmten mit den erhaltenen Signalen von DMB-markierten Oligo-/PolySia-Ketten an frischem Probenmaterial überein.Auch bei der Pathogenese von neoplastischer Metastasierung kommt PolySia-NCAM, aufgrund der Korrelation zwischen dem Gehalt an polysialyliertem NCAM und dem Metastasierungspotenzial eine außerordentliche Bedeutung zu. Mit der Verknüpfungsanalyse, basierend auf einer Permethylierung von Oligo- und Polysialinsäuren nach Markierung mit DMB, gelang es, das Detektionslimit signifikant zu erhöhen, mit dem unschätzbaren Vorteil der direkten Anwendbarkeit an frisch gewonnenem Gewebe ohne vorangehende Reinigungsschritte. Selbst bei kleinen Probenmengen, gleich welchen Ursprungs, eignet sich das beschriebene Verfahren aufgrund der hohen Sensitivität exzellent zur Identifikation vorkommender Sialinsäurearten und zur Verknüpfungsanalyse der Monomerbestandteile. Im klinischen Rahmen besteht damit die Möglichkeit, neue Erkenntnisse bezüglich des Einflusses von PolySia auf biologische Prozesse zu gewinnen. Außerdem könnten so neue PolySia-basierte Biomarker für neuronale bzw. neoplastische Erkrankungen etabliert werden, Biopsien umgehend analytisch aufgearbeitet und die pathologische Begutachtung erleichtert werden. Dies alles steht auch vor dem Hintergrund möglicher Prognoseeinschätzung, Abschätzung des Metastasierungsverhaltens von Tumoren und Entwicklung neuer krankheitsspezifischer Therapieansätze. The post-translational polysialylation of the neural cell adhesion molecule (NCAM), a member of the immunoglobulin superfamily, has been discussed playing an important role during brain development, functional processes of the nervous system and the regeneration of neuronal structures. In this study, we evaluated methods for in situ characterization of the polysialylation of the neural cell adhesion molecule NCAM. Due to the wide availability of formalin fixed tissue, it was of interest to adapt the methods of analysis for the detection of polySia, as these have been used only on freshly obtained material. Initial studies revealed the effect of the preservation by formalin on the degree of detection of polysialylation of the tissue by means of chromatographic methods. Through various preanalytical purification steps we were finally able to eliminate the artifacts stemming from inactivation of the fluorescent dye, with typical peak distribution. The reproducible chromatograms with the possibility of determining chain length were consistent with the signals obtained from DMB-labeled oligo-/polySia chains of fresh sample material. Also in the pathogenesis of neoplastic metastasis polySia-NCAM has an extraordinary relevance, due to the correlation between the content of polysialylated NCAM and the metastasis potential. With the linkage analysis, based on a permethylation of oligo-/polysialic acids after DMB-labeling we succeeded in increasing the detection limit significantly with the inestimable advantage of direct applicability to freshly obtained tissue without prior cleansing steps. Even with small amounts of sample, irrespective of their origin, the method described is suitable for identification of occurring sialic acid species and glycosidic linkage analysis of the monomer components because of its high sensitivity. In the clinical setting, there is the possibility of yielding new findings about the influence of polySia on biological processes. In addition, new polySia-based biomarkers for neuronal or neoplastic diseases could be established, biopsies processed immediately analyzed and pathological assessments be facilitated. All this stands against the background of possible prognostic assessment, rating of metastatic invasion of tumors and the development of new disease-specific therapeutic approaches.