Rolle und Regulation der intrazellulären Caspaseaktivität für die Influenzavirus-Replikation

Abstract

Influenza-A-Viren (IAV) stellen jedes Jahr eine Bedrohung für die Gesundheit vieler Menschen dar. In der IAV-infizierten Zelle werden nicht nur eine Vielzahl von Signalkaskaden ausgelöst, um den Eindringling zu bekämpfen, sondern das Virus weiß auch die Wirtszelle so zu manipulieren bzw. die antiviralen Mechanismen so auszunutzen, dass die eigene Replikation vorangetrieben wird. Für die Entwicklung von antiviralen Strategien ist es daher wichtig, das komplexe Zusammenspiel der Virusreplikation mit den in der Wirtszelle ausgelösten Signalwege zu verstehen. Da IAV das segmentierte Genom im Kern der Wirtszelle replizieren, ist es für die Bildung neuer infektiöser Virionen an der Zellmembran unabdingbar, dass das virale Genom in Form von Ribonukleoproteinkomplexen (RNPs) aus dem Kern transportiert wird. Im Rahmen dieser Arbeit wurde die Bedeutung der Apoptosesignalkaskade für den RNP-Kernexport bzw. für die Replikation des IAV und deren Regulation in der IAV-infizierten sekundären Zellkultur untersucht. Dabei wurde gezeigt, dass der RNP-Kernexport (i) für Influenzaviren aller drei Genera (A, B, C) und (ii) in verschiedenen sekundären Zelllinien und primären Zellen Caspase 3-abhängig ist. Hierfür mussten spezielle Immunfluoreszenzmethoden und Infektionsprotokolle etabliert werden. Weiterhin wurde durch nichtvirale Induktion der Apoptose und qualitative bzw. quantitative Analyse bestätigt, dass die Erhöhung des Kernporendiffusionslimits, die während der IAV-Infektion beobachtet wird, Caspase 3-abhängig ist. Außerdem konnte in dieser Arbeit erstmals gezeigt werden, dass der aktive, Crm-1-abhängige RNP-Transport zu späten Zeitpunkten des viralen Replikationszyklus von dem passiven, Caspase 3-abhängigen Export ersetzt bzw. ergänzt wird. Diese Ergebnisse sind Teil einer zur Publikation eingereichten Arbeit über die Bedeutung der influenzavirusinduzierten, caspaseabhängigen Vergrößerung der Kernporen für den RNP-Kernexport. Weitere Ergebnisse zur Untersuchung der Regulation der Apoptosesignalwege in einer für die IAV-Vermehrung genutzten permanenten Zellkultur zeigen, dass (i) in IAV-infizierten MDCK-II-Zellen die TRAIL-abhängige Caspase 3-Aktivierung über den extrinsischen Weg eher eine untergeordnete Rolle spielt und dafür (ii) der intrinsische Weg für die IAV-induzierte Caspase 3-Aktivierung und damit für die Virusreplikation essentiell ist. Ebenfalls wurden (iii) konträre Modelle zur regulativen Funktion von ERK für die Apoptosesignalkaskaden überprüft. Dabei wurde erstmals für IAV-infizierte MDCK-II-Zellen gezeigt, dass aktives ERK den intrinsischen Apoptosesignalweg und somit die Caspase 3-Aktivität negativ reguliert. Influenza A virus (IAV) poses a major threat to human health every year. In the IAV-infected cell a multitude of signaling pathways are induced to fight the invader, but the virus has evolved strategies to modulate or counteract these antiviral cellular responses to enhance the own replication. In order to develop antiviral strategies, it is important to understand the complex interplay between the viral replication and the cellular-induced signaling pathways. IAV replicates its genome in the nucleus of the host cell and for the production of progeny infectious virions at the cell membrane it is therefore important, that the viral genome, packaged in ribonucleoprotein complexes (RNP), is efficiently exported from the nucleus. In this thesis I analyzed the role as well as the regulation of the apoptosis signaling cascade for the RNP-export and IAV replication in secondary cell culture. The results demonstrate, that the RNP-export (i) for all three influenza virus genera (A, B, C) and (ii) in different secondary cell lines and in primary cells is caspase 3-dependent. For this, special immunofluorescence methods and infection protocols had to be established. By non-viral induction of the apoptosis and quantitative and qualitative analysis it was furthermore confirmed, that the increase of nuclear pore diffusion limits, which is observed in IAV-infected cells, is caspase 3-dependent. Moreover, I demonstrate here for the first time, that the active, Crm-1-dependent RNP-export switches to a passive, caspase 3-dependent export late in the virus life cycle. These results are part of a publication about IAV-induced caspase-dependent enlargement of nuclear pores, promoting nuclear RNP-export. Further work on the regulation of the apoptotic signaling pathway in a permanent cell culture, that is commonly used for IAV-replication, indicates that (i) in IAV-infected MDCK-II-cells the TRAIL-dependent activation of caspase 3 via the extrinsic pathway plays a minor role, but (ii) the intrinsic pathway instead is important for IAV-induced caspase 3-activity and thereby for efficient virus replication. Furthermore, (iii) the regulative role of ERK on the apoptotic signal pathway was investigated. Here I could show for the first time, that in IAV-infected MDCK-II-cells ERK negatively regulates the intrinsic pathway and thereby the caspase 3-activity.