The TGF-beta/BMP system in human pulmonary artery smooth muscle cells exposed to hypoxia

Abstract

Pulmonary arterial hypertension (PAH) is a rare but serious condition. In PAH abnormal proliferation of smooth muscle cells (SMCs) leads to a decreasing diameter of the vessel and an increase in resistance, resulting in an elevated pulmonary arterial pressure and right heart failure.PAH can be found as idiopathic, heritable or in association with multiple other conditions. This thesis focuses on PAH in context to the members of the transforming growth factor beta (TGF-beta) family and especially activin receptor like kinase 1 (ALK1) in human pulmonary artery smooth muscle cells (hPASMCs), since mutations in the genes coding for the TGF-beta family members BMPR-II and ALK1 have been linked to the development of PAH. To imitate PAH, cells were exposed to hypoxia as a stimulus of PAH.On mRNA level significant upregulation was observed for the TGF-beta receptors ALK1 and ALK5 after exposure of hPASMCs to hypoxia for 48 hours compared to the control group. The TGF-beta receptors ALK2, ALK3, ALK4, ALK6, TGF-betaRII, BMPRII and Endoglin also showed the tendency of upregulation after 48 hours exposure to hypoxia. Of the mediators of the TGF-beta pathway Smad2 - Smad5 and Smad8 showed the tendency of increased mRNA expression after 48 hours exposure to hypoxia. Among the target genes of the TGF-beta family members ID2 was significantly upregulated after 48 hours exposure to hypoxia and ID1 as well as PAI-1 showed a general tendency of upregulation upon exposure to hypoxia. On protein level no significant changes in expression could be detected when comparing hypoxia to normoxia exposed cells. The proliferation assay of hPASMCs indicated that proliferation of not transfected hPASMCs takes place under hypoxic stimulation, while for ALK1 siRNA transfected cells no significant data could be shown. Furthermore ALK1 could be localised in the hPASMCs by immunofluorescence both under normoxic and hypoxic conditions.This work explores the characteristics of TGF-beta pathway family members, especially the role of ALK1, in hPASMCs under hypoxia and normoxia. For some of the investigated genes, an altered expression under hypoxic conditions on mRNA level could be demonstrated, yet there were no corresponding changes on protein level. An influence of ALK1 on migration and proliferation of hPASMCS could not be shown. To further evaluate the impact of the TGF-beta pathway family members on the behaviour of hPASMCs under hypoxic and normoxic conditions, additional experiments need to be performed. Pulmonale arterielle Hypertonie (PAH) ist eine seltene aber ernste Krankheit. Bei der PAH führt anomale Proliferation von glatten Muskelzellen (SMC) zu einer Verringerung des Gefäßdurchmessers und einer Zunahme des Widerstandes. Dies führt zu einem erhöhten pulmonalen arteriellen Druck sowie Rechtsherzversagen.PAH kann idiopathisch, erblich oder in Verbindung mit multiplen anderen Krankheiten vorkommen. Die vorliegende Arbeit untersucht den Zusammenhang zwischen Mitgliedern der transforming growth factor beta (TGF-beta) Familie und insbesondere activin receptor like kinase 1 (ALK1) in humanen pulmonalen arteriellen glatten Muskelzellen (hPASMCs) und der PAH, da Mutationen in Genen, die für die TGF-beta Familienmitglieder BMPRII und ALK1 kodieren, in Verbindung mit der Entwicklung einer PAH gebracht werden. Um eine PAH zu imitieren, wurden die Zellen Hypoxie als Stimulus zur Entwicklung einer PAH ausgesetzt.Nachdem die hPASMCs 48 Stunden Hypoxie ausgesetzt waren, konnte unter den TGF-beta Rezeptoren eine signifikante Hochregulation auf mRNA-Ebene für ALK1 und ALK5 im Vergleich zur Kontrollgruppe beobachtet werden. Die TGF-beta Rezeptoren ALK2, ALK3, ALK4, ALK6, TGF-betaRII, BMPRII und Endoglin tendierten ebenfalls zur Hochregulation nach 48 Stunden Hypoxieexposition. Unter den Mediatoren des TGF-beta Signalweges zeigten sowohl Smad2 - Smad5 als auch Smad8 die Tendenz einer erhöhten mRNA Expression nach 48 Stunden Hypoxieexposition. Von den Zielgenen der TGF-beta Familie zeigte sich ID2 nach 48 Stunden Hypoxieexposition signifikant hochreguliert, zudem zeigten ID1 als auch PAI-1 eine generelle Tendenz zur Hochregulation unter Hypoxieexposition. Auf Protein-Ebene konnten keine signifikanten Veränderungen der Expression im Vergleich von Normoxie zu Hypoxie gezeigt werden. Das Proliferationsassay der hPASMC zeigt, dass nicht transfizierte hPASMCs unter Hypoxie proliferieren, während für ALK1 siRNA transfizierte Zellen keine signifikanten Daten gezeigt werden konnte. Weiterhin konnte ALK1 sowohl unter hypoxischen als auch normoxischen Bedingungen in hPASMCs mittels Immunfluoreszenz dargestellt werden.Diese Arbeit untersucht die Rolle der Mitglieder der TGF-beta Signalkette, insbesondere von ALK1, in hPASMCs unter Hypoxie und Normoxie. Für einige der untersuchten Gene konnte eine veränderte Expression auf mRNA-Ebene unter hypoxischen Bedingungen gezeigt werden, jedoch konnten keine dementsprechenden Veränderungenauf Protein-Ebene nachgewiesen werden. Ein Einfluss von ALK1 auf die Migration und Proliferation von hPASMCs konnte nicht gezeigt werden. Um den möglichen Einfluss der Mitglieder der TGF-beta Signalkaskade auf das Verhalten von hPASMCs unter Normoxie und Hypoxie besser beurteilen zu können, sind weitere Experimente erforderlich.