Der Einfluss von Phosphodiesterasen auf kontraktile Zellen des menschlichen Hodens und Nebenhodens

Abstract

Eine Voraussetzung für den Erhalt der männlichen Fertilität ist die intakte Funktion der peritubulären Myofibroblasten der Samenkanälchen im Hoden und der glatten Muskelzellen des Nebenhoden (NH)-Gangs. Eine mögliche Ursache für die Unfruchtbarkeit beim Mann ist eine pathologische Veränderung der Samenkanälchen mit fibrotisch verdickter Lamina propria (LP), was zu verminderter Produktion bzw. gestörtem Transport von Spermatozoen führt.Das Signalmolekül zyklisches Guanosinmonophosphat (cGMP) ist zentraler Botenstoff für die Funktion der kontraktilen Zellen und steuert deren Relaxation. Die Wirkung von cGMP wird durch Phosphodiesterasen (PDEs) zeitlich und räumlich begrenzt. In der vorliegenden Arbeit sollten PDEs in Hinblick auf die Kontraktilität der Muskelschicht des Hodens und NH näher untersucht werden.Im Hoden konnten Isoformen aller 11 bekannten PDE-Familien nachgewiesen werden. Die Etablierung einer neuen Methode auf der Basis der Laser-Capture- Mikrodissektion (LCM) ermöglichte PDE-Transkripte zelltypspezifisch eindeutig zuzuordnen. Sowohl in normaler als auch fibrotischer LP konnten so die PDE-Isoformen PDE1A, PDE1B, PDE3B, PDE5A, PDE8A, PDE9A und PDE10A lokalisiert werden, während die Transkripte von PDE2A, PDE3A, PDE8B und PDE11A fehlten. Als Besonderheit war die PDE1C-Expression nur in normaler, aber nicht in fibrotischer, LP zu finden. Nach Kultivierung peritubulärer Zellen von fibrotischer LP wurde PDE1C aber wieder exprimiert. PDE5A-mRNA konnte in der LP und in Keimzellen, jedoch nicht in Sertoli-Zellen nachgewiesen werden. PDE8B-Transkripte zeigten sich nur in Leydig-Zellen. Zusätzlich wurde die LCM für Western Blot-Analysen etabliert. Exemplarisch wurden cGMP-generierende Enzyme und die PDE2A in isolierten Samenkanälchen nachgewiesen.Bei kultivierten peritubulärer Zellen zeigte sich, dass PDE5A und PDE1A die höchste PDE-Expression in Zellen der normalen LP aufwiesen, gefolgt von PDE1C und PDE8A, während die PDE5A in Zellen der fibrotischen LP vor allen anderen am stärksten exprimiert war. Die Expression der PDE-Isoformen wies nur geringe Unterschiede zwischen einzelnen Passagen auf. In Übereinstimmung damit konnte auch gezeigt werden, dass der myofibroblastische Phänotyp der einzelnen Zellen auf Transkript- und Proteinebene in Kultur erhalten blieb. Überraschenderweise fand sich auch bei klassischen Muskelzellen von Pulmonalarterie (HPASMCs) und Prostata (HPrSMCs) in Kultur ein solcher Myofibroblasten-Phänotyp.Im NH-Gang konnten beim Menschen PDE5A-Transkripte in der Muskelschicht, aber nicht im Epithel nachgewiesen werden. PDE3A und PDE3B fehlten beim Menschen, waren aber in der Muskelschicht des Ratten-NH zusammen mit PDE1, PDE2 und PDE5A exprimiert. Regionsabhängige Unterschiede zeigten sich für PDE1 mit einer Abnahme von Caput nach Cauda, während PDE2 im Corpus am höchsten exprimiert war. PDE3A, PDE3B sowie PDE5A waren in allen drei Abschnitten nahezu gleich stark exprimiert. Im Organbad konnte durch Einsatz spezifischer PDE-Inhibitoren die funktionelle Bedeutung dieser PDEs für die Kontraktilität des NH-Ganges gezeigt werden. Daneben konnten auch die zugehörigen cGMP-generierenden Enzyme auf Transkript- und Proteinebene sowie ihre Liganden in den NH-Abschnitten nachgewiesen werden. Die zelltypspezifische Expression und Funktion von PDE-Isoformen spricht für eine fein regulierte Steuerung des cGMP-Systems der kontraktilen Zellen von Hoden und NH mit Bedeutung für das Verständnis männlicher Infertilität und Arzneimittelnebenwirkungen. Im Gegensatz zu normaler LP fehlt die PDE1C in fibrotisch veränderter LP, wird in isolierten Zellen unter Kulturbedingungen jedoch erneut exprimiert. Dieser Befund deutet auf eine besondere Rolle dieses Enzyms beim Proliferationsgeschehen und bei der Fibroseentwicklung (nicht nur im Hoden) hin. The functional integrity of peritubular myofibroblasts of seminiferous tubules of the testis and smooth muscle cells of the epididymal duct is a prerequisite for male fertility. A pathological disturbance of seminiferous tubules with fibrotic and thickened lamina propria (LP) leads to reduced production and disturbed transport of spermatozoa and coincides with male infertility. The messenger molecule cyclic guanosine monophosphate (cGMP) represents an important mediator of contractile cell function and thereby regulates relaxation. The duration of cGMP action is limited spatially and temporally by phosphodiesterases (PDEs). This study describes the PDE isoforms with regard to contractility of smooth muscle cells of the male reproductive tract.In the testis, PDEs of the eleven families described so far were detected. By a new approach of Laser-Capture-Microdissection (LCM) cell type-specific PDE expression could be demonstrated. By this procedure PDE1A, PDE1B, PDE3B, PDE5A, PDE8A, PDE9A and PDE10A could be localized to regular and fibrotic LP, but transcripts of PDE2A, PDE3A, PDE8B and PDE11A were shown to be absent. PDE1C expression was found in regular, but not in fibrotic LP. In cultured peritubular cells from fibrotic LP, however, PDE1C expression was again detectable. PDE5A-mRNA could be located in LP and germ cells, but not in Sertoli cells. PDE8B transcripts were found only in Leydig cells. Additionally, LCM was established for Western blot analyses. For example, cGMP-generating enzymes and PDE2A could be detected in isolated seminiferous tubules. In cultured peritubular cells of regular LP PDE5A and PDE1A showed the highest expression of all PDEs, followed by PDE1C and PDE8A. In cultured cells from fibrotic LP PDE5A expression predominated compared to all other PDEs. Culturing only slightly affected PDE expression when comparing different passages of peritubular cells. In agreement, the myofibroblast phenotype of single cells was preserved both at the transcript and protein level under culture condition from passage to passage. Surprisingly, typical smooth muscle cells from human lung artery (HPASMCs) und prostate (HPrSMCs) also showed a myofibroblast phenotype under culture condition.In the human epididymis, PDE5 transcripts could be detected in the smooth layer of the duct, but not in epithelium. PDE3A and PDE3B transcripts were absent in the human epididymal duct, but could be localized to the smooth muscle layer of the rat epididymal duct together with PDE1, PDE2 and PDE5A. PDE1 expression declined from caput to cauda, whereas PDE2 showed its highest expression in the corpus region. PDE3A, PDE3B and PDE5A were expressed in equal amounts in all parts of the epididymis. Functional relevance of PDEs for contractile cell function was demonstrated in organ bath studies using specific PDE inhibitors. Furthermore, the corresponding cGMPgenerating enzymes and their ligands could be detected in the different regions of the epididymal duct both at the transcript and protein level.The cell type-specific expression and function of PDE isoforms point to a wellorchestrated regulation of cGMP signaling for contractile cell function of the testis and epididymis. This might be important for the understanding of male infertility and side effects of various drugs. Compared to regular LP, PDE1C is absent in fibrotic LP in situ, but is expressed again in isolated cells under culture conditions, indicating a special role of PDE1C for cell proliferation and development of fibrosis, not only in the testis but also in other organs.