Stickstoffmonoxid als weiteres Signalmolekül in der TGFbeta-induzierten Apoptose adulter Kardiomyozyten der Ratte

Abstract

Bei anhaltender Druckbelastung des Herzens kommt es zu einem Übergang von hypertrophem Wachstum zur Entwicklung einer Herzinsuffizienz, die unter anderem mit einer gesteigerten TGFbeta1-Expression und Apoptose-Induktion einhergeht. In adulten Kardiomyozyten induzieren TGFbeta1 sowie Stickstoffmonoxid (NO) Apoptose, die über Transkriptionsfaktoren der SMAD-Familie vermittelt wird. Primäres Ziel dieser Arbeit war es zu klären, ob NO eine kausale Bedeutung in diesem TGFbeta1-vermittelten Signalweg hat.Zur Überprüfung dieser Fragestellung wurde ein in vitro Zellkultur-Modell mit isolierten ventrikulären Kardiomyozyten der adulten Wistar Ratte verwendet. In dieser Arbeit konnte mittels HOE-Assay und Caspase 3/7-Assay gezeigt werden, dass TGFbeta1 bei adulten Kardiomyozyten via den TGFbeta1-Rezeptor ALK5 Apoptose induziert, da diese Apoptose-Induktion mit dem ALK5-Inhibitor SB431542 supprimierbar ist. Des Weiteren konnte bestätigt werden, dass TGFbeta1 via ALK5 SMAD2 phosphoryliert und diese Phosphorylierung mit SB431542 supprimierbar ist.Die NO-Freisetzung wurde durch einen DAF-Assay gemessen. Hierbei zeigte sich, dass TGFbeta1 eine NO-Freisetzung induziert und dass diese NO-Freisetzung ALK5-Rezeptor vermittelt ist, da die NO-Freisetzung mit SB431542 supprimierbar war.Zur Klärung der Frage, ob NO-Synthasen für die NO-Freisetzung verantwortlich sind, wurde ETU als unspezifischer Inhibitor der NOS eingesetzt. Es zeigte sich, dass NO-Synthasen für die NO-Freisetzung verantwortlich sind. Zur Differenzierung der verantwortlichen NO-Synthase wurde der iNOS-spezifische Inhibitor 1400W und der nNOS-spezifische Inhibitor TFA eingesetzt. Weder die Hemmung der iNOS noch die Hemmung der nNOS konnte die TGFbeta1-induzierte NO-Freisetzung hemmen. Somit muss die NO-Freisetzung durch TGFbeta1 über die eNOS erfolgen. Mittels Immunfluoreszenz konnte eine TGFbeta1-abhängige Phosphorylierung der eNOS an Serin 1177 nachgewiesen werden. Somit konnte gezeigt werden, dass TGFbeta1 in adulten Kardiomyozyten der Ratte eine ALK5-vermittelte NO-Freisetzung induziert. Darüber hinaus konnte gezeigt werden dass die PI3-Kinase nicht an der NO-Freisetzung beteiligt ist. Eine Hemmung der PI3-Kinase mit dem Inhibitor Ly294002 hat keinen Einfluss auf die TGFbeta1-induzierte und ALK5-vermittelte NO-Freisetzung. Es konnte jedoch gezeigt werden, dass die PI3-Kinase an der TGFbeta1-induzierte Apoptose beteiligt ist. Eine Inhibition der PI3-Kinase mit Ly294002 oder Wortmannin supprimierte die TGFbeta1-induzierte Apoptose. Dies konnte im HOE-Assay und im Caspase 3/7-Assay nachgewiesen werden. Somit ist die PI3-Kinase proapototisch an der TGFbeta1-induzierten Apoptose beteiligt. Außerdem konnte gezeigt werden, dass die PI3-Kinase an der Expression TGFbeta1-abhängiger pro-apoptotischer Gene wie SHIP, Tieg1 als auch SMAD7 beteiligt ist. Ebenso bewirkt die PI3-Kinase eine erhöhte Bindungsaktivität der TGFbeta1-abhängigen Transkriptionsfaktoren AP1 und SMAD.Als Fazit lässt sich konstatieren, dass die TGFbeta-1induzierte Apoptose eine komplexe Signalkaskade ist, in der NO ein fester TGFbeta1-induzierter und ALK5-vermittelter Bestandteil ist. Die verantwortliche NO-Synthase stellt die eNOS dar, die mittels Phosphorylierung durch TGFbeta1 aktiviert wird. Die PI3-Kinase ist an dieser pro-apoptotischen TGFbeta1-induzierten Kaskade beteiligt, hat jedoch keinen Einfluss auf die NO-Freisetzung. A sustained cardiac pressure load leads to transition from compensated hypertrophy to heart failure. This transition is accompanied by enhanced TGFbeta1 expression und apoptosis induction. In adult cardiomyocytes apoptosis is induced by TGFbeta1 and nitric oxide, mediated via the transcription factors of the SMAD family. Primary target of this work was to investigate whether nitric oxide is causally involved in TGFbeta1-induced apoptosis.To answer our questions we used an in vitro modell of isolated ventricular cardiomyocytes of adult Wistar rats. In this work it could be shown by HOE-assay and by Caspase 3/7 assay that TGFbeta1 induces in adult cardiomyocytes via ALK5 receptor apoptosis as apoptosis-induction could be blocked by the ALK5 receptor inhibitor SB431542. Further it could be confirmed that TGFbeta1 phosphorylates SMAD2 via ALK5 and this phosphorylation could be blocked by SB431542.The nitric oxide formation was measured by DAF-Assay. In this context it could be shown, that TGFbeta1 induces nitric oxide formation and this nitric oxide formation is mediated via ALK5 receptor, because NO production was blocked by SB431542. To answer the question, if NO-synthases are responsible for the nitric oxide formation, we used the unspecific inhibitor of NO synthases ETU. It could be shown.that NO synthases are the origin of nitric oxide formation. To identify the responsible NO synthase we used the iNOS-specific inhibitor 1400W and the nNOS-specific inhibitor TFA. Both inhibitors did not block NO formation under TGFbeta1. Therefore, eNOS must be responsible for NO production. A TGFbeta1 dependent phosphorylation of eNOS at Serin 1177 could be detected by immunofluorescence. This shows that TGFbeta1 induces an ALK5-mediated nitric oxide formation in adult cardiomyocytes of rat.Furthermore, involvement of PI3K in NO formation could be excluded, because an inhibition of PI3-Kinase via Ly294002 has no impingement on TGFbeta1-induced and ALK5-mediated nitric oxide formation. However, it could be revealed that PI3-Kinase is involved in TGFbeta1 induced apoptosis. Inhibtion of PI3-Kinase by Ly294002 or by Wortmannin inhibits TGFbeta1-induced apoptosis. This could be shown by HOE-assay and Caspase 3/7 assay. Thus, PI3-Kinase is involved in the expression of TGFbeta1-dependent pro-apoptotic genes like SHIP, Tieg1 and SMAD7. The PI3-Kinase also mediates an increased binding-activity of TGFbeta1-dependent transcription factors AP1 and SMAD. In conclusion, it can be stated, that the TGFbeta1-induced apoptosis is an complex signaling pathway, in which nitirc oxide is an TGFbeta1-induced and ALK5-mediated integral part. The responsible NO-synthase is the eNOS, which is activated by phosphorylation upon TGFbeta1 stimulation. The PI3-Kinase is part of the pro-apoptotic pathway, but has no influence on nitirc oxide formation.