Experimentelle Untersuchungen zum Proliferationsverhalten von NSCLC-Zelllinien unter Endotoxin-Stimulation : die Rolle des Cyclooxygenase-Metabolismus

Abstract

Lungenkarzinome haben weltweit eine hohe Inzidenz und Mortalität. Da pulmonale Infektionen zusätzlich zum Lungenkarzinom nicht nur die Diagnose erschweren, sondern auch die Prognose verschlechtert, sollte ein möglicher Zusammenhang zwischen Infektion und Tumorprogression in der vorliegenden Arbeit genauer betrachtet werden. Hierzu wurden Versuche durchgeführt, bei denen drei NSCLC-Zelllinien (A549, H1299, H226) mit verschiedenen Konzentrationen des Endotoxins LPS, Membranbestandteil von gramnegativen Bakterien, inkubiert wurden. Für alle drei untersuchten Zelllinien konnte eine LPS-induzierte Proliferationszunahme mittels quantitativer Zellzahlmessung, MTS-Assay, BrdU ELISA und 3H-Thymidin-Assay ermittelt werden, wobei die Zellzahlmessung die validesten und reproduzierbarsten Daten ergab. Der Einfluss der COX sollte bei dieser induzierten Proliferationszunahme überprüft werden, da diesem Enzym schon bei verschiedenen anderen Tumorentitäten ein hoher Stellenwert zugeschrieben wurde. Somit wurden der unselektive COX-Inhibitor Indomethacin und der selektive COX-2-Inhibitor NS-398 eingesetzt. Hierbei zeigte sich, dass die Aktivierung der COX-2 entscheidend für die Endotoxin-mediierte Zellproliferation war. Unter den COX-Mediatoren konnte lediglich PGE2 in nennenswerten Konzentrationen nach Endotoxin-Stimulation quantifiziert werden. Die darauf folgende Analyse der PG Prostaglandinrezeptor-Expression zeigte, dass basal alle vier EP-Subtypen EP1-EP4 an allen drei Zelllinien exprimiert werden. Interessanterweise fand sich unter Endotoxin-Stimulation eine Hochregulation der EP1-EP3, weswegen für die folgenden Versuche zur Charaktersierung der Rolle der EP-Aktivierung bei der LPS-vermittelten NSCLC Proliferation der breite EP-Antagonist AH-6809 mit Spezifität für EP1, EP2, und EP3 eingesetzt wurde. In allen drei Zelllinien war in Anwesenheit des EP-Antagonisten die LPS-induzierte Steigerung der Tumorzellproliferation aufgehoben, ohne dass das Pharmakon die basale Proliferation beeinflusste. Schließlich wurde untersucht, ob es unter Endotoxingabe zu einer Sekretion des pro-angiogenen Faktors VEGF kommt und inwieweit hier die EP-Aktivierung eine Rolle spielt. Alle drei Zelllinien zeigten eine erhöhte Konzentration von VEGF im Zellüberstand nach LPS-Stimulation. Dieser Effekt konnte genauso wie die Zellproliferation durch den EP-Antagonisten AH-6809 selektiv blockiert werden. Zusammenfassend induziert Endotoxin eine Proliferation an drei unterschiedlichen NSCLC-Zelllinien. Die COX-2 anhängige PGE2-Sekretion und konsekutive EP-Aktivierung scheint sowohl für die pro-proliferativen als auch für die Endotoxin-mediierte VEGF-Sekretion zentral involviert zu sein. Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit könnten somit Ausgangspunkt für eine gezielte Forschung am Einsatz von Prostaglandinrezeptor-Antagonisten in der Therapie des NSCLC darstellen und die bisherigen therapeutischen Ansätze ergänzen. Worldwide, the incidence and mortality of lung cancer is high. Since pulmonary infections complicate the diagnosis and even worsen the prognosis of lung cancer, we characterized the reciprocal interactions between pulmonary infection and lung tumor growth in more detail. For that purpose, three NSCLC cell lines (A549, H1299, and H226) were incubated with various concentrations of the endotoxin LPS as a membrane component of gram-negative bacteria. An LPS-induced increase in proliferation could be detected for all three cell lines by means of direct cell quantification, MTS assay, BrdU ELISA and 3H Thymidine assay, with direct cell quantification producing the most reliable and reproducible data. The role of Cyclooxygenase (COX) - activation was examined in LPS-induced NSCLC proliferation, as this enzyme has been considered to play an essential role in various other tumor entities. Unselective COX-inhibition was performed by indomethacin, while NS-398 was used as selective COX-2-inhibitor. In these experiments, COX-2 activation was shown to be essential for endotoxin-induced cellular proliferation. Among COX-derived metabolites, only PGE2 was detected in the cell supernatants of endotoxin-stimulated NSCLC-cells. The following characterization of PGE2 receptor (EP) expression by RT-PCR demonstrated that all EP-subtypes (EP1-EP4) were expressed by the NSCLC cell lines. Interestingly, expression of EP1, EP2, and EP3 was up-regulated upon endotoxin stimulation. Therefore, an EP-receptor antagonist AH-6809, displaying inhibitory activity for these receptor subtypes was used to examine the role of EP-activation in LPS-induced tumor cell proliferation. In all cell lines, AH-6809 completely abrogated the LPS-induced increase in NSCLC proliferation, while basal proliferation was not affected by the EP-antagonist. Finally, we asked whether stimulation with endotoxin was followed by secretion of the pro-angiogenic factor VEGF. Moreover, the role of EP-activation was characterized in this context. In all cell lines, an increase in VEGF-secretion was detected upon exposure to LPS. As previously shown for cellular proliferation, LPS-induced secretion of VEGF was selectively abrogated in the presence of the EP-antagonist AH-6809. In conclusion, endotoxin induced proliferation in three different human NSCLC cell lines. COX-2 dependent secretion of PGE2 and consecutive activation of specific EP-receptors mediates the pro-proliferative effects of endotoxin. Moreover EP-activation is centrally involved in endotoxin-dependent secretion of VEGF. These results may give reason for examining the role of EP-activation in NSCLC in more detail and potentially affect the development of future therapeutic strategies in NSCLC.