Identifikation von polysialylierten Glykoproteinen im Nebenhoden der Ratte sowie auf humanen und bovinen Spermien

Abstract

PolySia ist ein Homopolymer aus alpha-2,8-verknüpften Sialinsäuren, den Derivaten der N-Acetylneuraminsäure (Neu5Ac), welches erstmals 1982 im Gehirn von Ratten identifiziert wurde. Aufgrund seiner negativen Ladung erhöht PolySia als posttranslationale Modifikation von Glykoproteinen dessen hydrodynamischen Radius, was wiederum den interzellulären Spalt um die Trägerproteine erhöht und Zell-Zell-Kontakte lösen kann. Dieser Effekt wurde erstmals beim Neural Cell Adhesion Molecule nachgewiesen, wodurch die Zellmigration, Zelladhäsion, die Neurogenese und die synaptische Plastizität während der Entwicklung des vertebralen Nervensystems beeinflusst wird. Zu den polysialylierten Glykoproteinen bei Säugetieren zählen zudem die lösliche Form von CD36, die in humaner Milch und der von Mäusen nachgewiesen wurde, die alpha-Untereinheit der Natriumkanäle im Rattenhirn, eine Subfraktion von SynCAM 1 im Mäusehirn, sowie eine polysialylierte Form von NRP-2 auf humanen dendritischen Zellen. Die Synthese von PolySia aus Sialinsäuren erfolgt durch die beiden Sialyltransferasen ST8SiaII und ST8SiaIV. Vorangegangene Versuche durch Herrn Sören Bäumner führten zur Identifikation von PolySia auf bovinen und humanen Spermien. Da zwar die Lokalisation der PolySia auf den Spermien im postakrosomalen Bereich bestimmt werden konnte, das polysialylierte Glykoproteine jedoch unbekannt blieb, war das Ziel dieser Dissertation, diese zunächst auf Rattennebenhoden zu identifizieren und anschliessend mittels humanem Ejakulat zu verifizieren. Die Analyse präzipitierter PolySia aus Rattennebenhoden nach tryptischem Verdau mittels MALDI-TOF-MS(MS) führte zur Identifikation von NCAM und ST8SiaII als polysialylierte Glykoproteine. Damit konnte sowohl erstmals, NCAM im Nebenhoden eines Säugetieres nachgewiesen, als auch Autopolysialylierung von ST8SiaII in vivo beobachtet werden. Massenspektrometrische Untersuchungen der Proben nach PNGaseF-Verdau zeigten, dass PolySia bei der Autopolysialylierung von ST8SiaII an der N-Glykosylierungsstelle von Asn219 sitzt, welche sich zwischen dem sialyltransferase motif L und der Polysialyltransferasen-Domäne (PSTD) befindet.Durch Fluoreszenzfärbungen konnte eine Koloka-lisation von PolySia+NCAM und PolySia+ST8SiaII gezeigt werden. Dabei wurde deutlich, dass das Signal von PolySia dem der Glykoproteine überwog. Auch war nur ein Bruchteil aller Spermien PolySia-positiv. Welche Rolle die polysialylierten Glykoproteine im Ejakulat haben, bedarf jedoch weiterer Studien. Polysialic acid (polySia) is a homopolymer of alpha-2,8-linked sialic acids, the derivatives of N-acetylneuraminic acid (Neu5Ac), which was firstly found in rat brain in 1982. This post-translational modification of glycoproteins increases the hydrodynamic radius due to its negative charge, increasing the intercellular gap to the carrier proteins and release cell-cell contacts. This effect was initially described for the polysialylated form of the neural cell adhesion molecule and affects cell migration, cell adhesion, neurogenesis and synaptic plasticity during the development of the vertebral nervous system. The polysialylated glycoproteins in mammals include the soluble form of CD36, which has been observed in human milk and in milk of mice, the alpha-subunit of sodium channels in rat brains, a subfraction of SynCAM 1 in the mouse brain as well as a polysialylated form of NRP-2 on human dendritic cells. PolySia can be generated by two sialyltransferases ST8SiaII and ST8SiaIV. Previous studies by Sören Baeumner led to the identification of polySia on bovine and human sperm. Even though the localization of polySia could be visualized on the postacrosomale area of sperm, the polysialylated glycoproteins, however, still remain unknown. Thus, the aim of this dissertation is to identify those glycoproteins in rat epididymis and to verify this findings using human ejaculate. The analysis of precipitated polySia from rat epididymis after tryptic digestion by MALDI-TOF-MS(MS) led to the identification of NCAM and ST8SiaII as polySia carriers. It was the first time that NCAM could be detected in the epididymis of mammals and that ST8SiaII can be autopolysialylated in vivo. Mass spectrometric analysis of the samples after PNGaseF- digestion demonstrated that polySia is bound to the N-glycosylation site Asn219 during autopolysialyltion of ST8SiaII, which is located between the sialyltransferase motif L and polysialyltransferasedomain (PSTD). By fluorescence staining a colocalisation of polySia + NCAM and polySia + ST8SiaII could be shown. It became apparent that the signal of polySia is more intense than the signal of the glycoproteins, furthermore just a fraction of the analysed sperm was polySia-positive. The biological functions of the polysialylated glycoproteins in ejaculates is, however, unknown and it has to be investigated in further studies.