Dual non-coding RNA profiles of host and bacteria and their role in the regulation of innate immune response during Listeria monocytogenes infection

Abstract

During the course of infection, the pathogens follow several strategies to evade from the host defense system and to adapt to the host environment for efficient survival. Meanwhile the host imposes several cellular processes, innate and adaptive immune systems to fight back against the pathogens. At molecular level, the pathogens deploy different strategies, mainly by modulating their gene expression profiles as per the intercellular and intracellular compartments of the host. Similarly, the host also alters its gene expression profile specific to each pathogen to protect itself. For a longtime, proteins were considered to be predominant molecules to regulate gene expression. With the discovery of regulatory non-coding RNAs (ncRNAs) in both prokaryotes and eukaryotes this assumption had to be reconsidered. These regulatory ncRNAs not only opened a new branch in the understanding of gene regulation but also furthermore represented possible biomarkers for diagnostic purposes or leverage points for drug targets. In this context, we took effort to study the functional roles of these eukaryotic non-coding RNAs (miRNAs) from the perspective of host-pathogen interactions and host immune responses during infections. In this thesis, efforts are made to reveal host miRNA response to model pathogen L. monocytogenes in different infection models (Caco-2 cells and G. mellonella) along with bacterial ncRNA (asRNAs) profilling during their intracellular survival in P388D1 macrophages. The first part of the study revealed the altered miRNA response in Caco-2 cells that were infected with L. monocytogenes. Using different mutant strains (deltahly and deltainlAB), which are unable to invade epithelial cells and escape from phagocytic vacuoles, we demonstrated that miRNA response is dependent on the subcellular localization of L. monocytogenes and its virulence determinants. Even the purified endotoxin LLO from L. monocytogenes is able to regulate significant miRNAs in Caco-2 cells. The correlation of selected miRNAs and their predicted target gene expression levels uncovered roles of miRNAs in fine-tuning of immune related gene expression during L. monocytogenes infection. In continuation of the first study, the second part involved elucidation of miRNA response to L. monocytogenes infection in invertebrate infection model G. mellonella and its role in host-microbial interactions. Insect specific miRNA microarray analysis demonstrated the deregulation of miRNA response with upregulation of 39 and downregulation of 58 miRNAs upon infection of L. monocytogenes in G. mellonella. Some of the miRNAs regulation patterns are conserved between vertebrates and invertebrates, as we observed the downregulation of conserved miRNAs miR-133 and miR-998 (homologous to miR-29) both in higher mammals and G. mellonella with bacterial infections. We observed pathogen/non-pathogen specific miRNA regulation in this insect model, when we compared miRNAs expression patterns with pathogenic L. monocytogenes and non-pathogenic L. innocua infections. Later, we established a public database, which would be very useful to study insect-microbial interactions that can correlate even with higher animals. qRT-PCR analysis of predicted target genes such as spätzle, MAP kinase and optineurin demonstrated the role of miRNAs in Toll pathway, MAP-kinase pathway and autophagy process with pathogenic L. monocytogenes infection.In the third part of the thesis, bacterial ncRNAs especially asRNAs that are involved in metabolic adaptations and virulence of L. monocytogenes are unveiled using different sequencing technologies such as SOLiD and Ion torrent technologies. By using SOLiD platform, several antisense RNAs were identified and some of them were associated with regulation of housekeeping genes like purA, fumC and pgi, thereby involved in metabolic adaptations of L. monocytogenes. In another study, Ion torrent based sequencing of intracellularly grown L. monocytogenes RNA revealed the existence of long noncoding RNAs that overlap internalins, methylases and potassium uptake system (kdpABCD operon), highlighting their probable role in regulation of various group of genes.In conclusion, the thesis provides crucial insights over the ncRNAs mediated regulation of host immune response, role in listerial adaptations to intracellular environment as well as the interplay between host and pathogens. Während einer mikrobiellen Infektion nutzen Krankheitserreger verschiedene Strategien um dem Abwehrsystem des Wirtes zu entgehen und sich an die Bedingungen des Wirtsmilieus für ein effizientes Wachstum anzupassen. Der infizierte Wirt wiederum reagiert mit diversen zellulären Prozessen auf die Infektion, wie z.B. mit der Aktivierung des angeborenem und/oder adaptivem Immunsystems. Die Strategien der Erreger auf molekularer Ebene beinhalten oft die Modulierung der Genexpressionsaktivität beim Wechsel zwischen inter- und intrazellulären Bedingungen. Um sich zu schützen, ändern auch die Wirtszellen in gleicher Weise ihre Expressionsaktivität in Reaktion auf eine mikrobielle Infektion. Lange Zeit ging die Wissenschaft davon aus, dass die Genexpression allein durch Proteinfaktoren bestimmt wird. Mit der Entdeckung von nicht-kodierenden RNA Transkripten (ncRNAs) in Eukaryoten wie auch in Prokaryoten musste diese Meinung jedoch revidiert werden. Damit erweitern ncRNAs nicht nur das Verständnis über die Mechanismen der Genregulation, sondern können gleichermaßen auch potentielle Biomarker für diagnostische Zwecke darstellen bzw. sich als Angriffspunkt für neue Therapeutika nutzen lassen. Vor diesem Hintergrund, haben wir uns zum Ziel gesetzt, die Rolle dieser ncRNAs für Wirt-Pathogen-Interaktionen sowie die Immunantwort des Wirts nach Infektion zu untersuchen. Die vorliegende Arbeit untersucht zunächst die miRNA-Antwort des Wirtes nach Infektion mit dem Modelkeim L. monocytogenes in verschiedenen Infektionsmodellen wie der humanen Darmepithelzelllinie Caco-2 und der großen Wachsmottenlarve (Galleria mellonella). Des Weiteren, wurden ncRNA-Profile von L. monocytogenes vor und nach Infektion der humanen Makrophagen-Zelllinie P388D1 analysiert, um die bakterielle Adaption zu beleuchten. Der erste Teil der Arbeit behandelt die Identifizierung von miRNA-Profilen von Caco-2-Zellen in Antwort auf Listerien-lnfektionen. Mit Hilfe direkten Vergleichs von Infektion mit L. monocytogenes und verschiedener chromosomaler Deletionsmutanten (deltainlAB und deltahly), die nicht mehr in der Lage sind in Caco-2-Epithelzellen zu invadieren oder aus dem Phagolysosom zu entkommen, konnten wir zeigen, dass die miRNA-Antwort abhängig von der Lokalisierung der Listerien ist. Ferner, war auch aufgereinigtes Listerien-Toxin Listeriolysin (LLO) in der Lage, das miRNA-Profil von Caco-2-Zellen signifikant zu ändern. Eine Korrelation zwischen ausgewählten miRNAs und der Geneexpression ihrer vorhergesagten Zielgene zeigte die Rolle der miRNAs in der Abstimmung der Expression von Immun-zugehörigen Genen während der Infektion.In der Fortführung des ersten Teils, befasst sich der zweite Teil der Arbeit mit der Aufklärung der miRNA-Antwort der großen Wachsmottenlarve G. mellonella nach L. monocytogenes-Infektion. Durch die Verwendung von Insekten-spezifischen DNA-Mikroarrays konnte die differentielle Regulation von 117 miRNAs der Wachsmotte nach Infektion gezeigt werden. Davon waren 39 miRNAs signifikant hoch- und 58 signifikant runterreguliert. Eine komparative bioinformatische Analyse dieser miRNAs zeigte, dass einige dieser miRNAs zwischen Vertebraten und Invertebraten konserviert sind. So wurden die von uns gefundenen Herunterregulierungen der miRNAs miR-133 und miR 998 auch in höheren Säugetieren nach bakterieller Infektion beschrieben. Darüber hinaus konnten die Deregulation in Pathogenitäts- und nicht-Pathogenitäts-abhängige Regulation unterklassifiziert werden, indem wir Referenzversuche mit den nicht-pathogenen Listerienstamm L. innocua durchführten. Abschließend etablierten wir basierend auf der Arbeit eine öffentlich-zugängliche Datenbank zur Vorhersage von Zielgenen von miRNAs, die hilfreich für die weitere Untersuchung von Insekten-Mikroorganismen-Interaktionen sein wird. qRT-PCR-Analysen von identifizierten Zielgenen wie z.B. spätzle und Optineurin zeigten, dass miRNAs in der Toll- bzw. MAP-Kinase-Signaltransduktionskaskade und Autophagie involviert sind.Im dritten Teil dieser Arbeit wurden mittels verschiedener Sequenziertechnologien, wie SOLiD oder Ion Torrent, bakterielle ncRNAs untersucht, die während der intrazellulären Überlebensphase exprimiert werden. Die Studie unter Verwendung der SOLiD-Sequenzierplattform lieferte Hinweise für Genregulationen durch Antisense-Transkription z. B. für die Haushaltsgene purA, fumC und pgi. Dies weist auf eine Beteiligung von antisense Regulation dieser Gene bei der metabolischen Anpassung während des intrazellulären Überlebens hin. Die Ion Torrent-basierende Transkriptomstudie von intrazellulär wachsenden Listerien indentifizierte darüber hinaus auch lange ncRNAs. Diese langen ncRNAs sind gegen Internaline, Methylasen und das Kaliumaufnahmesystem (kdpABCD-Operon) gerichtet und lassen somit eine vielfältige regulatorische Wirkung auf Transkriptionsebene auf eine diverse Gruppe von Gene erahnen.Zusammenfassend erbringt diese Arbeit sowohl grundlegende Einsichten in die ncRNA-gesteuerte Anpassung des Erregers L. monocytogenes an intrazelluläre Bedingungen als auch die ncRNA-gesteuerte Erreger-Wirt-Interaktion.