Frühkindliche Netzhautdegeneration Kopplungsanalyse und Kandidatengenansatz auf Chromosom 1 zur Identifikation des ursächlichen Gens in einer konsanguinen Familie mit frühkindlicher Netzhautdegeneration

Abstract

Ziel dieser Dissertation war es, die ursächliche Mutation für die schwere frühkindliche Netzhautdegeneration in einer konsanguinen kurdischen Familie mit fünf betroffenen Familienmitgliedern zu identifizieren.Vorab waren Mutationen in RetGC1, RPE65, LRAT, AIPL1, CRX, CRB1, CEP290, RPGRIP, TULP1 und GUCY2D ausgeschlossen worden. Über Kopplungsanalysen, mit Hilfe des Affymetrix Mapping 50k Xba 240 Array (Affymetrix, High Wycombe, UK) durch das Max Delbrück Center für Molekulare Medizin (Berlin-Buch) über das Modell eines autosomal rezessiven Erbgangs mit dem Programm ALOHOMORA und MERLIN, erfolgte die Eingrenzung des möglichen Genlocus. Dieser Kopplungsbereich auf Chromosom 1q31-32 wurde mittels Feinkartierung mit Mikrosatelittenmarkern und dem Programm MERLIN weiter eingegrenzt. Der Genlocus konnte hiermit nahe des RD3 Locus kartiert werden. Eine anschließende Suche in UniSTS und dbSNP Datenbanken von NCBI (National Center for Biotechnology Information) ergab 7 mögliche Kandidaten-Gene in diesem Bereich, deren Eigenschaften und vermuteten Funktionen sie als Kandidatengene hervorhoben. Dabei war RD3 besonders interessant. Die Sanger-Sequenzierung ergab eine Nonsens-Mutation im RD3-Gen, welche in allen erkrankten Familienmitgliedern homozygot vorlag. Es handelt sich um eine Nonsens Mutation (p.Y60x (c.180C>A)) im Exon 1 des RD3-Gens bei der Cytosin durch Adenin ersetzt wird und daraufhin ein vorzeitiges Stop-Codon entsteht.Der durch das Stop Codon verursachte frühzeitige Abbruch der mRNA-Synthese führt wahrscheinlich zu einem vorzeitigen Abbau der mRNA und zum vollständigen Funktionsverlust von RD3. Dies hat zur Folge, dass der durch RD3 beeinflusste Transport von RetGC in die Außensegmente der Photorezeptorzellen gestört wird und die durch RD3 verursachte Hemmung von RetGC verloren geht, wodurch es zu einem Anstieg von cGMP in den Photorezeptorinnensegmenten kommt. Weitere biochemische Funktionen von RD3 sind derzeit noch unbekannt, weshalb weiterführende Forschungen zukünftig zu erwarten sind, um therapeutische Verfahren entwickeln zu können.Die Auswertung der klinischen Untersuchungsergebnisse der fünf Betroffenen der Familie konnten über einen Alterszeitraum zwischen 3 Monaten und 22 Jahren ausgewertet werden. Die klinische Symptomatik, die mit der hier gefundenen Mutation im RD3-Gen einhergeht, äußert sich in ausgeprägter Nachtblindheit, einem deutlich eingeschränkten Gesichtsfeld, einer schweren Visusminderung, einem ausgeprägten Nystagmus, einer erhöhten Blendempfindlichkeit und einem ERG, dass kongenital unter der Nachweisgrenze lag. Fundusveränderungen waren bereits in den ersten Lebensjahren zu erkennen und die durchgeführten OCT-Untersuchungen ergaben eine mit fortschreitendem Lebensalter zunehmende Reduktion der Retinadicke und früh erkennbare und zunehmende Desorganisation der Netzhautschichten als Zeichen der retinalen Degeneration. Die Etablierung von Tiermodellen zur Entwicklung und Erprobung kurativer therapeutischer Verfahren, wie z.B. der somatischen Gentherapie bei LCA12, bedürfen zunächst noch zukünftiger Forschung bezüglich der Funktion von RD3. Eine gute Grundlage hierfür bieten die vergleichbaren Erkrankungen mit Mutationen im RD3-Gen bei Mäusen (rd3 Mäuse) sowie Hunden (rcd2 Collis). Es existieren bereits erste Ergebnisse zum Versuch der somatischen Gentherapie bei rd3 Mäusen.Die Chance auf eine kurative Therapie durch Anwendung der somatischen Gentherapie setzt eine frühe Diagnosestellung bei Patienten mit RD3-Mutation vorraus, noch vor Beginn der Photorezeptorzelldegeneration, da es sich um eine Erkrankung mit schwerem Phänotyp mit frühem Beginn handelt. Zudem sollten weitere Genotyp-Phänotyp Korrelationen zur Verbesserung der klinischen Datenlage bezüglich des Degenerationsprozesses erfolgen. Auch hier ist zukünftig eine weiterführende Forschung Voraussetzung. The purpose of this thesis was to identify the causal mutation of an early onset retinal degeneration in a Kurdish family with five affected people. Mutations in RetGC1, RPE65, LRAT, AIPL1, CRX, CRB1, CEP290, RPGRIP, TULP1 and GUCY2D have been excluded. Genlocus identification was performed by means of linkage analysis under a model of autosomal recessive inheritance with Affymetrix Mapping 50k Xba 240 Array (Affymetrix, High Wycombe, UK) by Max Delbrück Center für Molekulare Medizin (Berlin-Buch) by application of the ALOHOMORA and MERLIN software.The linkage area on chromosome 1q31-32 was mapped next to the RD3 locus by using microsatellite marker and the linkage program MERLIN. Seven possible candidate genes with interesting function and characteristics were detected by prospecting UniSTS and dbSNP databases of NCBI (National Center for Biotechnology Information). RD3 was highlighted. A homozygote nonsense mutation in the affected family members was identified by Sanger-sequencing. The nonsense mutation in RD3 exon 1 creates a new stop-codon that is generated through a change from Cytosin to Adenin. This new stop-codon is probably the reason for premature degradation of the mRNA which leads to a loss of functionality of RD3. The result is an increase of cGMP because of a disturbed transport of RetGC into the outer segment of the photoreceptor cell and the loss of the inhibitory function from RD3 on RetGC. Other biochemical function of RD3 are not identified jet. This is the reason why experimental research in the future will be necessary for the development of a therapeutic treatment. The results of the clinical examination of the five affected persons of the family with ages ranging from 3 months to 22 years were night blindness, limited visual field, nystagmus, glare sensitivity and an ERG below threshold. Transformation of the ocular fundus could be detected during the first years of live. OCT- examination detected increasing reduction of retinal thickness with disorganisation of all retinal layers indicating retinal degeneration.In order to establish an LCA12 animal model for developing and testing therapeutic treatment such as somatic gene therapies, additional research on RD3 function is needed in the future. The comparable disease of mutation in rd3-mice and rcd2-collies offers a good basis. There are first results available of experiments with regard to somatic genetherapie with rd3-mice. In order to be able to use somatic gene therapy, it is necessary to make an early diagnosis of people with mutations in RD3, before the start of the photoreceptor cell degeneration to account for the severe phenotype with very early beginning. Additional genotype-phenotype-correlations are necessary regarding the process of the retinal degeneration upon the recoded clinical data. Continuing experimental research is absolutely essential in the future.